Năm 1959, Baker và cộng sự cho rằng xử lý kháng nguyên Vi PS bằng acid acetic nóng gây ra một vài thoái biến trong phân tử kháng nguyên Vi PS nên đã thử tinh chế bằng phƣơng pháp nhẹ hơn (phƣơng pháp điện di). Họ nuôi cấy vi khuẩn
C. freundii 5396/38 ở 37oC trong môi trƣờng (Phụ lục 2) và tách tế bào khỏi canh khuẩn bằng ly tâm 35.000 g ở 4oC. Tinh chế và thu đƣợc kháng nguyên Vi PS hòa tan trong nƣớc, đệm trung tính và đệm acetate [44,53,54]. Tuy nhiên, sản phẩm từ phƣơng pháp điện di không sử dụng đƣợc do nó loại đƣợc rất ít tạp chất trong sản
31
phẩm nhƣ gốc acid nucleic. Gốc này không thẩm tích đƣợc ở dung dịch NaCl 2 M và chiếm từ 1,5 – 3% trong sản phẩm. Sau đó, kháng nguyên Vi PS đƣợc tinh chế bằng phƣơng pháp điện di lại đƣợc khử trùng hợp bởi sóng âm thanh. Phƣơng pháp này làm giảm 80% độ nhớt đặc hiệu và giảm 40 lần trọng lƣợng phân tử kháng nguyên Vi PS, trung bình từ 1,6 x 106 xuống 3,9 x 104. Phƣơng pháp này cũng không làm thay đổi cấu trúc hóa học đáng kể, hàm lƣợng N-acetyl và O-acetyl không thay đổi, nhƣng hiệu quả chỉ còn 1% so với kháng nguyên gốc và hiệu giá kháng thể cũng nhƣ tỷ lệ bảo vệ thấp hơn ở chuột nhắt và thỏ khi tiêm thử thách bằng chủng S. Typhi. Trong phản ứng ngƣng kết, kháng nguyên không mất khả năng ngƣng kết đặc hiệu với kháng thể cũng nhƣ tính nhạy [65,78].
Kháng nguyên Vi PS sau khi điều chế bằng phƣơng pháp điện di đƣợc thủy phân bởi kiềm nhẹ NaOH 0,1 N trong 2 giờ tại nhiệt độ phòng và trọng lƣợng phân tử của kháng nguyên Vi PS đã biến đổi. Trƣớc khi thủy phân, trọng lƣợng phân tử là 1,7 x 106 và sau khi thủy phân trọng lƣợng phân tử giảm còn 1,0 x 105 và nhóm O-acetyl bị loại bỏ hoàn toàn. Độ nhớt giảm từ 8,0 decilit/g xuống khoảng 0,5 decilit/g. Trong khi đó, xử lý bằng sóng âm thanh tạo ra một vài loại sản phẩm khử trùng hợp khác nhau hơn là dùng phƣơng pháp thủy phân hóa học làm thay đổi hóa học phân tử polymer [55].
Theo Robbins & Robbins, kỹ thuật điều chế trên đã làm biến tính kháng nguyên Vi PS vì đã loại bỏ một nửa hàm lƣợng O-acetyl và N-acetyl và giảm lƣợng lớn phân tử kháng nguyên Vi PS. Vắc xin đã đƣợc Hornick và cộng sự thử trên ngƣời tình nguyện nhƣng không cho hiệu quả bảo vệ do cấu trúc kháng nguyên Vi PS đã mất hoạt tính bảo vệ [50,95].
1.6.1.2. Điều chế kháng nguyên Vi PS trong điều kiện không biến tính
Việc tạo miễn dịch thành công bằng kháng nguyên PS tinh chế từ
Haemophilus influenzae type b, Neisseria meningitidis nhóm A & C và Pneumococci là tiền đề cho phát triển vắc xin Thƣơng hàn Vi PS.
32
Đến năm 1974, K. H. Wong và John C. Feely dùng kỹ thuật tinh chế trong điều kiện không biến tính với Cetavlon để điều chế kháng nguyên Vi PS nhƣ điều chế PS của pneumococcus và meningococcus [49]. Bằng kỹ thuật mới, kháng nguyên Vi PS đƣợc điều chế cho hoạt tính bảo vệ gấp 8 lần đến 199 lần ở chuột so với phƣơng pháp thủy phân bằng acid [80]. So với vắc xin Thƣơng hàn toàn tế bào bất hoạt bằng acetone (5 x 108 tế bào) thì vắc xin Thƣơng hàn Vi PS (50 g) cho khả năng bảo vệ gấp 9 lần. Vắc xin này an toàn và có tính sinh miễn dịch khi đƣợc thử trên ngƣời tình nguyện ở Pháp [106,107].
Chủng S. Typhi Ty2 và C. ferundii đƣợc dùng để điều chế kháng nguyên Vi PS và sản phẩm đƣợc kiểm tra độ tinh khiết và kích thƣớc phân tử theo phƣơng pháp dùng cho tiêu chuẩn hóa vắc xin PS não mô cầu và phế cầu. Kết quả kiểm tra cho thấy hàm lƣợng protein và acid nucleic 1%, hàm lƣợng chất gây sốt đạt theo qui định của WHO và US FDA. Kháng nguyên có kích thƣớc phân tử tƣơng tự với kích thƣớc phân tử của kháng nguyên PS từ vi khuẩn não mô cầu và vi khuẩn phế cầu [78].
Vi khuẩn C. freundii cũng thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae
và có kháng nguyên Vi PS đƣợc dùng làm mô hình để nghiên cứu về kháng nguyên Vi PS. Tuy nhiên, kháng nguyên Vi PS đƣợc điều chế từ S. Typhi khác với kháng nguyên Vi PS đƣợc điều chế từ C. freundii ở chỗ trọng lƣợng phân tử lớn hơn, mức độ O-acetyl hóa cao hơn. Đây là 2 tiêu chuẩn để đánh giá hiệu quả bảo vệ của kháng nguyên Vi PS. Theo Landy và cộng sự, kháng nguyên Vi PS điều chế từ
S. Typhi có công hiệu cao hơn kháng nguyên Vi PS điều chế từ C. freundii [49,78].