Chủng S. Typhi Ty2 và C. freundii 3596/38 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch nƣớc chiết thịt bê ở 37oC. Thu kháng nguyên Vi PS bằng NaCl 0,85% với 0,1% Natri azide, cắt ADN, ARN bằng enzyme DNase, RNase/37oC, cắt protein bằng enzyme protease ở 37oC. Tiếp theo dùng ethanol tinh chế và tủa bằng Cetavlon, sản phẩm cuối cùng đƣợc đông khô. Việc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch có hạn chế về
33
hiệu suất thu kháng nguyên Vi PS. S. Typhi tiết kháng nguyên Vi PS trong quá trình nuôi cấy vào môi trƣờng, cho nên ngƣời ta hƣớng nghiên cứu đến việc nuôi cấy vi khuẩn Thƣơng hàn trong môi trƣờng lỏng ở nồi lên men từ qui mô nhỏ đến qui mô lớn. Đó là do nuôi cấy ở nồi lên men có độ đồng nhất cao, dễ theo dõi nhiệt độ và pH cũng nhƣ việc thu kháng nguyên Vi PS thuận lợi hơn. Kháng nguyên Vi PS đƣợc tủa từ nƣớc nổi của dịch nuôi cấy, tinh chế rồi đông khô và đƣợc bảo quản trong phenol. Việc tinh chế không làm biến tính kháng nguyên Vi PS, giữ đƣợc cấu trúc phân tử và kết quả tạo đƣợc vắc xin Thƣơng hàn Vi PS có công hiệu cao hơn [107].
- Điều chế kháng nguyên Vi PS bằng nuôi cấy S. Typhi trong nồi lên men (NIH):
Chủng S. Typhi Ty2 đông khô (do Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ cung cấp) đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng (Phụ lục 3). Nhân giống trên môi trƣờng thạch TSB 0,9% ở 37oC. Nuôi cấy vi khuẩn trong nồi lên men và kết thúc nuôi cấy ở giai đoạn cuối của pha log. Bất hoạt vi khuẩn bằng formalin 37% ở tỷ lệ 0,5% (thể tích/thể tích). Thu kháng nguyên Vi PS thô bằng tủa với Cetavlon 0,2% và tách tủa bằng NaCl 1 M. Tinh chế bằng ethanol 99%, dùng men DNase, RNase để cắt ADN, ARN ở 37oC, cắt protein bằng men protease ở 37oC. Tiếp theo là dùng phenol để tinh chế. Cuối cùng, ly tâm 35.000 vòng/phút ở 5oC trong 5 giờ thu nƣớc nổi. Sản phẩm kháng nguyên Vi PS có hàm lƣợng protein và acid nucleic 1%. Kích thƣớc phân tử đƣợc kiểm tra qua Gel Sepharose CL-2B có hệ số phân bố là 0,3. Kết quả hàm lƣợng Vi PS sau 24 giờ nuôi cấy đạt đƣợc 7,34 mg/lít môi trƣờng nuôi cấy [42].