giờ. Mẫu phân thành 3 lớp theo trọng lƣợng phân tử gồm lớp trên cùng là kháng nguyên Vi PS, lớp giữa màu trắng đục là protein và acid nucleic biến tính, lớp dƣới cùng là phenol.
Tách lấy lớp kháng nguyên Vi PS, ly tâm 15.000 g ở 10oC trong 1 giờ để thu nƣớc nổi và bỏ cặn. Lặp lại 3 – 4 lần giai đoạn tủa mẫu kháng nguyên Vi PS bằng phenol cho đến khi lớp giữa còn rất mỏng. Thẩm tích mẫu kháng nguyên Vi PS bằng túi celophan trong nƣớc cất ở 4oC trong 48 giờ, để loại phenol ra ngoài.
+ Thu mẫu kháng nguyên Vi PS tinh khiết
Phƣơng pháp nhằm loại bỏ LPS (endotoxin) và loại bỏ lần nữa protein và acid nucleic còn lại trong mẫu kháng nguyên Vi PS.
- Nguyên tắc: Trong thành phần LPS có lipid, sử dụng CaCl2.2H2O liênkết các thành phần này với nhau, ly tâm tốc độ cao thì loại bỏ LPS cùng protein và acid thành phần này với nhau, ly tâm tốc độ cao thì loại bỏ LPS cùng protein và acid nucleic còn lại trong mẫu kháng nguyên Vi PS.
- Tiến hành:
Thu kháng nguyên Vi PS bằng tủa với ethanol 99,99% đến nồng độ ethanol 75% và ly tâm 4.000 g ở 4oC trong 1 giờ lấy cặn, bỏ nƣớc nổi. Hoàn nguyên mẫu kháng nguyên Vi PS trong CaCl2.2H2O 0,01 M, khuấy tan và ly tâm 136.000 g ở 10oC trong 3 giờ để thu nƣớc nổi có kháng nguyên Vi PS.
58
Mẫu đƣợc thẩm tích bằng túi celophan trong nƣớc cất ở 4oC trong 72 giờ. Đông khô kháng nguyên Vi PS. Kiểm tra chất lƣợng kháng nguyên Vi PS (Phụ lục 9 và 10).
2.3. Pha vắc xin [74]
* Pha vắc xin theo công thức:
Thành phần 1 liều/0,5 ml vắc xin Thƣơng hàn Vi PS
+ Kháng nguyên Vi polysaccharide tinh khiết 0,025 mg + Phenol tối đa 1,25 mg + NaCl 4,15 mg + Na2HPO4 0,0515 mg + NaH2PO4. 2H2O 0,023 mg
pH = 7,0 ± 0,5
Pha kháng nguyên Vi PS trong dung dịch đệm đẳng trƣơng thành vắc xin Thƣơng hàn Vi PS. Lọc vô trùng qua lọc Cartridge (0,2 m) và phân vào thùng chứa bằng inox. Lấy mẫu kiểm tra bán thành phẩm Thƣơng hàn Vi PS (Phụ lục 11). - Vắc xin đƣợc đóng lọ 1 ml vắc xin chứa 2 liều và 10 ml vắc xin chứa 20 liều. - Sau khi kiểm tra vật lý đạt yêu cầu, lọ vắc xin đƣợc dán nhãn gồm các thông tin: Số lƣợng, lô số, hạn dùng, màu sắc, số đăng ký đúng mẫu đã đăng ký.
- Đóng hộp: Mỗi hộp đóng 10 lọ cùng với giấy hƣớng dẫn sử dụng và dán nhãn niêm phong bên ngoài. Hộp vắc xin đƣợc bảo quản tại kho lạnh 2 – 8oC.
- Lấy mẫu: Số lƣợng mẫu theo quy định kiểm tra chất lƣợng vắc xin (Phụ lục 10). - Sau khi có giấy cho phép sử dụng, vắc xin sẽ đƣợc nhập vào kho thành phẩm và đƣợc xuất xƣởng đƣa vào sử dụng.
2.4. Phƣơng pháp kiểm định (Phụ lục 9 và 10)[45,108,109]
Kiểm tra chất lƣợng kháng nguyên Vi PS và vắc xin Thƣơng hàn Vi PS theo Dƣợc điển châu Âu và quy định của TCYTTG.
59
với chất lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS sản xuất bởi Pasteur Merieux (Pháp). - Xác định số lƣợng liều vắc xin Thƣơng hàn Vi PS của mỗi loạt nuôi cấy.
2.5. Hình thành quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở quy mô nồi lên men 300 lít men 300 lít
Dựa trên các kết quả nghiên cứu về chủng giống, lên men, tinh chế, thu kháng nguyên Vi PS, chất lƣợng kháng nguyên Vi PS hình thành quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở quy mô nồi lên men 300 lít [14,15, 24,83,87,88,89].
2.6. Sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS theo thông số đã chọn và khảo sát tính ổn định của quy trình sản xuất ổn định của quy trình sản xuất
Dựa vào quy trình sản xuất và các thông số đã chọn để sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS. Sử dụng đồ thị kiểm soát Shewhart để đánh giá tính ổn định của quy trình.
SƠ ĐỒ SẢN XUẤT THEO THÔNG SỐ ĐÃ KHẢO SÁT
2.7. Khảo sát tính ổn định của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS
Khảo sát tính ổn định của vắc xin để đánh giá chất lƣợng của vắc xin và có đƣợc những dữ liệu cần thiết hỗ trợ việc cấp giấy phép. Nghiên cứu tính ổn định
Nuôi cấy S. Typhi Ty2 theo thông số đã khảo sát (20 mẻ) Bất hoạt vi khuẩn Thƣơng hàn: - OD560nm - Tỷ lệ formalin 37% (% = v/v) - Kiểm tra sống sót - Kiểm tra an toàn
Nuôi cấy: - Tỷ lệ giống (%) - OD560nm và pH lúc gặt Thu kháng nguyên Vi PS: - Hàm lƣợng kháng nguyên Vi PS/thể tích môi trƣờng (g/lít) - Hàm lƣợng kháng nguyên Vi PS/thể tích môi trƣờng (mg/lít) Hiệu suất: - Hàm lƣợng kháng nguyên Vi PS/loạt (mg/loạt) - Số lƣợng liều/loạt Kiểm tra chất lƣợng: - Kháng nguyên Vi PS - Vắc xin Thƣơng hàn Vi PS
60
cũng đƣợc thực hiện sau khi đƣợc cấp giấy phép để đảm bảo chất lƣợng vắc xin đƣợc duy trì trong suốt thời gian hạn sử dụng.
2.7.1. Thực hiện
Để xác định tính ổn định của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS dựa trên cơ sở kiểm tra hàm lƣợng O – acetyl và hàm lƣợng kháng nguyên Vi PS khi vắc xin đƣợc bảo quản ở những nhiệt độ khác nhau theo thời gian khác nhau:
Bảng 2.5. Khảo sát tính ổn định của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS Nhiệt độ (oC) Thời gian
17 – 25 3, 6, 9, 12 tháng 37 1, 2, 3, 4 tuần
2 – 8 6, 12, 18, 24, 36 tháng
2.7.2. Đánh giá kết quả
Kiểm tra hàm lƣợng kháng nguyênVi CPS và hàm lƣợng O – acetyl theo tiêu chuẩn của Dƣợc điển châu Âu và quy định của Tổ chức Y tế Thế giới. Phƣơng pháp kiểm tra nhƣ mục 2.4 [108,109].
2.8. Tiêu chuẩn kháng nguyên Vi PS và tiêu chuẩn vắc xin Thƣơng hàn Vi PS 2.8.1. Tiêu chuẩn kháng nguyên Vi PS 2.8.1. Tiêu chuẩn kháng nguyên Vi PS
Bảng 2.6. Tiêu chuẩn kháng nguyên Vi PS (Theo Dƣợc điển châu Âu và quy định của TCYTTG)
Stt Kiểm tra Phƣơng pháp Tiêu chuẩn
1 Hàm lƣợng protein Lowry 10 mg/g of Vi PS 2 Hàm lƣợng acid nucleic Phƣơng pháp đo quang 20 mg/g of Vi PS 3 Hàm lƣợng O – acetyl Hestrin 2 mmol /g of Vi PS 4 Kích thƣớc phân tử Sắc ký rây phân tử Có 50% Vi PS thoát ra
trƣớc khi Kd = 0,25
5 Nhận dạng Ouchterlony
Tạo cung kết tủa đặc hiệu giữa kháng nguyên Vi PS và kháng thể Vi
61
2.8.2. Tiêu chuẩn vắc xin Thƣơng hàn Vi PS
Bảng 2.7. Tiêu chuẩn vắc xin Thƣơng hàn Vi PS (Theo Dƣợc điển châu Âu và quy định của TCYTTG)
Stt Kiểm tra Phƣơng pháp Tiêu chuẩn
1 Vật lý Soi trực tiếp Dung dịch không màu, trong suốt, không lẫn chất lạ khó hòa tan 2 pH Đo bằng máy pH 7,0 0,5
3 Hàm lƣợng
O – acetyl Hestrin
0,085 ± 25% mol /liều (0,064 – 0,106 mol /liều)
4 Hàm lƣợng Vi Điện di miễn dịch 25 ± 30% g/liều (17,5 – 32,5
g/liều) 5 Hàm lƣợng
phenol Grifol và King Kind 1,25 mg/liều
6 Vô trùng Cấy trực tiếp Không có sự phát triển của vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy 7 Nhận dạng Ouchterlony Tạo kết tủa đặc hiệu giữa kháng
nguyên Vi PS và kháng thể Vi
8 An toàn
Tiêm 0,5 ml vắc xin cho mỗi chuột nhắt (5 chuột nhắt) và 0,5 ml vắc xin cho mỗi chuột lang (2 chuột lang)
Chuột khỏe mạnh, lên cân sau 7 ngày theo dõi. Không có chuột chết. 9 Chí nhiệt tố Tiêm tĩnh mạch thỏ 0,025 g kháng nguyên Vi PS/ml/kg thỏ
Vắc xin không đƣợc có chất gây sốt
2.9. Hiệu quả kinh tế, xã hội của đề tài luận án
- Đánh giá hiệu quả sử dụng vắc xin phòng bệnh Thƣơng hàn trong cộng đồng. - Đánh giá về hiệu quả kinh tế khi sử dụng vắc xin sản xuất trong nƣớc.
62
2.10. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở quy mô nồi lên men 300 lít men 300 lít
Dựa trên kết quả sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nồi lên men 300 lít và kết quả kiểm tra chất lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS theo tiêu chuẩn của Dƣợc điển châu Âu và quy định của Tổ chức Y tế Thế giới để xây dựng quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở quy mô nồi lên men 300 lít.
2.11. Xử lý số liệu [14]
2.11.1. Trung bình nhân (Geomean - theo phần mềm Microsoft Excel)
2.11.2. Độ lệch chuẩn (Standard Deviation - theo phần mềm Microsoft Excel)
2.11.3. Khoảng tin cậy 95% 2.11.4. Kiểm định t (t-test) 2.11.4. Kiểm định t (t-test)
2.11.5. Đánh giá tƣơng quan hồi qui