9.2.2. Kiểm tra đặc điểm sinh hóa
9.2.2.1. Kiểm tra khả năng lên men các loại đƣờng
a. Nguyên tắc: Vi khuẩn có khả năng lên men đƣờng tạo các sản phẩm có tính acid làm giảm pH môi trƣờng dẫn đến thay đổi màu của môi trƣờng. làm giảm pH môi trƣờng dẫn đến thay đổi màu của môi trƣờng.
b. Thực hiện : Xếp 2 dãy ống môi trƣờng Basikov, mỗi dãy 8 ống, ghi tên các loại đƣờng lên các ống. Nhỏ vào mỗi ống 0,1 ml đƣờng của 8 loại đƣờng vào 2 dãy trên đƣờng lên các ống. Nhỏ vào mỗi ống 0,1 ml đƣờng của 8 loại đƣờng vào 2 dãy trên (mỗi loại đƣờng nhỏ 2 ống), ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc điển hình có halo, cấy vào 1 ống canh thang TSB, ủ ở 37oC trong 5 giờ. Dãy 1: Cấy 0,1 ml canh khuẩn vào các ống môi trƣờng Basikov đã có đƣờng, ủ ở 37oC. Dãy 2: Là đối chứng. Theo dõi trong 14 ngày.
c. Kết quả: Sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 14 ngày:
Dƣơng tính: Môi trƣờng chuyển từ màu xanh sang màu vàng. Âm tính : Môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây.
9.2.2.2. Kiểm tra khả năng sử dụng citrate
a. Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng citrate (muối của acid citric trong chu trình Krebs) nhƣ nguồn hydratcarbon duy nhất và có khả năng lấy N2 từ trong chu trình Krebs) nhƣ nguồn hydratcarbon duy nhất và có khả năng lấy N2 từ muối amon để tạo thành NH4OH làm kiềm hóa môi trƣờng và thay đổi màu của chỉ thị màu.
b. Thực hiện: Cấy vào 2 ống nghiệm thạch nghiêng Citrate Simons 2 đƣờng thẳng
song song kéo từ dƣới đáy lên trên, ủ ở 37oC. Theo dõi trong 14 ngày.
c. Kết quả
Dƣơng tính: Môi trƣờng chuyển từ màu xanh lá sang màu xanh nƣớc biển. Âm tính : Môi trƣờng không chuyển màu.
9.2.2.3. Kiểm tra khả năng sinh H2S
a. Nguyên tắc: Vi khuẩn tổng hợp đƣợc enzyme desulfohydrate xúc tác chuyển hóa (điều kiện kỵ khí) các acid amin chứa lƣu huỳnh (S) nhƣ cysteine, cystin, (điều kiện kỵ khí) các acid amin chứa lƣu huỳnh (S) nhƣ cysteine, cystin, methionine và giải phóng H2S. Khí H2S sinh ra đƣợc nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen với chỉ thị sulfite trong môi trƣờng nuôi cấy (FeS, PbS). H2S có thể
tạo ra do phản ứng khử thiosulfate Na2S2O3 bởi enzyme thiosulfate reductase của vi khuẩn tạo sulfit và H2S.
desulfohydrate
Acid amin chứa S H2S
Thiosulfate reductase
Thiosulfate H2S
b. Thực hiện: Cấy vi khuẩn sâu từ đáy 2 ống nghiệm môi trƣờng thạch chì, kéo lên 3 đƣờng thẳng đứng giữa ống môi trƣờng, ủ ở 37oC trong khoảng 24 – 48 giờ. 3 đƣờng thẳng đứng giữa ống môi trƣờng, ủ ở 37oC trong khoảng 24 – 48 giờ.
c. Kết quả: Dƣơng tính: Môi trƣờng chuyển từ màu trắng sữa sang màu đen. Âm tính : Môi trƣờng không chuyển màu. Âm tính : Môi trƣờng không chuyển màu.
9.2.2.4. Kiểm tra thử nghiệm Urea-Indol a. Thử nghiệm Urea a. Thử nghiệm Urea
*Nguyên tắc: Urea (NH2)2CO là diamid của acid carbonic, vi khuẩn có enzyme urease thuộc nhóm amidase sẽ xúc tác thủy phân liên kết amide giữa C – N trong phântử urea tạo ammonia và carbondioxide dẫn đến làm tăng pH môi trƣờng:
(NH2)2CO + H2O 2 NH3 + CO2
* Thực hiện:Cấy vi khuẩn vào 2 ống môi trƣờng canh thang Urea-Indol, ủ ở 37oC
trong 24 giờ.
* Kết quả: Dƣơng tính: Môi trƣờng chuyển từ màu cam hồng nhạt sang màu đỏ cánh sen.
Âm tính : Không đổi màu.
b. Thử nghiệm Indol
* Nguyên tắc: Vi khuẩn có enzym tryptophanase có khả năng oxy hóa acid amin tryptophan tạo sản phẩm chứa gốc indol, acid pyruvic và NH3+. Indol sinh ra có nhân pyrrol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của p – dimethy laminobenzaldehyde có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức chất dạng quinone có màu đỏ.
* Thực hiện: Nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovacs vào 2 ống đã thử nghiệm phân giải ure.
* Kết quả: Dƣơng tính: Xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trƣờng. Âm tính : Xuất hiện màu vàng trên bề mặt môi trƣờng.
9.2.2.5. Kiểm tra thử nghiệm oxydase
a. Nguyên tắc: Thử nghiệm phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrome oxidase của vi khuẩn hiếu khí, hiếu kỵ khí tùy ý. Trong chuỗi truyền điện tử của quá trình của vi khuẩn hiếu khí, hiếu kỵ khí tùy ý. Trong chuỗi truyền điện tử của quá trình hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử sau cùng, hệ thống cytochrom C trong tế bào hoạt động nhƣ chất liên kết, vận chuyển H+ → O2 tạo thành nƣớc. Hoạt tính cytochrome oxidase đƣợc phát hiện nhờ thuốc thử p – phenylenediamine, thuốc thử bị oxy hóa thành indolphenol màu nâu đen.
b. Thực hiện: Lấy một ít vi khuẩn bôi lên giấy thử đã tẩm sẵn thuốc thử. Kết quả: Dƣơng tính: Phản ứng đổi màu từ tím sang nâu đen. Kết quả: Dƣơng tính: Phản ứng đổi màu từ tím sang nâu đen.
Âm tính : Không đổi màu.
9.2.3. Kiểm tra đặc tính ngƣng kết với huyết thanh đặc hiệu
a. Thực hiện: Dùng kháng huyết thanh đa giá và đơn giá để kiểm tra đặc tính ngƣng kết của chủng S. Typhi Ty2. Thứ tự, chủng ngƣng kết với kháng huyết thanh ngƣng kết của chủng S. Typhi Ty2. Thứ tự, chủng ngƣng kết với kháng huyết thanh đa giá Vi trƣớc, sau đó, chủng ngƣng kết với kháng huyết thanh đơn giá O:9, H:d. - Chia lam kính làm 2 phần: 1 phần làm đối chứng (chứng âm), 1 phần làm thí nghiệm.
- Nhỏ mỗi bên 1 giọt nƣớc muối sinh lý, lấy 1 ít khuẩn lạc (nuôi cấy 20 – 24 giờ ở 37oC), cho vào mỗi giọt nƣớc muối sinh lý, hòa nhuyễn thành huyền dịch.
- Nhỏ tiếp 1 giọt kháng huyết thanh bên phần thí nghiệm và 1 giọt nƣớc muối sinh lý bên phần đối chứng (chứng âm). Trộn đều.
- Quan sát sự ngƣng kết trong khoảng 1- 2 phút.
c. Kết quả: Dƣơng tính: Cụm ngƣng kết xuất hiện dạng bông xốp, nổi trên mặt huyền dịch ngƣng kết và trong dần xung quanh. huyền dịch ngƣng kết và trong dần xung quanh.
Âm tính : Huyền dịch đục hoặc vi khuẩn tụ lại ở trung tâm huyền dịch. Chứng âm: Huyền dịch vẫn đục đều.
PHỤ LỤC 10 Phƣơng pháp kiểm định Phƣơng pháp kiểm định
10.1. Xác định hàm lƣợng Protein (Phƣơng pháp Lowry)
Nguyên tắc: Trong môi trƣờng kiềm, protein phản ứng với Cu2+ tạo phức màu xanh, đồng thời xảy ra sự khử giữa phosphomolypdate-phosphotungstic acid trong thuốc thử Folin với amino axit vòng thơm trong protein đã phản ứng, tạo phức màu xanh hấp thụ ở bƣớc sóng = 760 nm
10.1.1. Tiến hành
- Lấy 1 ml dung dịch mẫu Vi PS 5mg/ml, thêm 0,15ml dung dịch acid trichloacetic 40%, để yên 15 phút. Ly tâm 5000 vòng trong 10 phút, lấy tủa protein. Thêm 0,8 ml dung dịch NaOH 0.1M.
- Cho vào 5 tube: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ml chuẩn BSA 100 µg /ml. Thêm vào các tube: 0,7; 0,6; 0,4; 0,2; 0 ml NaOH 0.1M. Nồng độ của BSA chuẩn là: 10, 20, 40, 60, 80µg/ml.Ống chứng: cho 0,8ml NaOH 0.1M vào tube thủy tinh 10 ml.
- Tube mẫu. Thêm vào tất cả các tube 4 ml dung dịch Cupri-tartaric. Lắc đều, để yên 10 phút. Thêm vào tất cả các tube 0.4 ml dung dịch Folin 1/2. Lắc đều, để yên trong tối 30 phút.
- Đo quang (OD) ở bƣớc sóng λ = 760 nm.
- Vẽ tƣơng đồ thị mối tƣơng quan giữa đƣờng nồng độ BSA chuẩn và mật độ quang tƣơng ứng theo hàmForecast trên máy tính. Tính hàm lƣợng protein trong mẫu theo