- Những phân tử kháng nguyênVi PS có kích thƣớc khác nhau sẽ tách ra khi chạy qua lọc gel.
10.7. Xác định hàm lƣợng O-acetyl trong vắc xin Thƣơng hàn Vi PS (Phƣơng pháp Hestrin)
pháp Hestrin)
Nguyên tắc: Nhóm O-acetyl (-COCH3) phản ứng với hydroxylammonium chloride trong môi trƣờng kiềm tạo thành acid hydroxamic. Trong môi trƣờng axit, Fe3+ phản ứng với acid hydroxamic tạo phức màu rƣợu vang hấp thụ ở bƣớc sóng = 540 nm.
10.7.1 Tiến hành
- Đƣờng chuẩn: Chuẩn bị 2 hàng, mỗi hàng 5 tube 10 ml. Hàng 1 là chứng, hàng 2 là phản ứng. Lần lƣợt cho vào các tube theo thứ tự : 2,9; 2,8; 2,5; 2,0; 1,5 ml nƣớc cất, thêm tiếp vào các tube theo thứ tự 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 1,5 ml acetylcholine chloride 150 µg/ml. Tube trắng: 3 ml nƣớc cất.
- Mẫu thử: Chuẩn bị 3 tube 10 ml, 1 tube chứng (ch), 2 tube phản ứng (pƣ). Cho vào mỗi tube 3 ml mẫu kháng nguyên Vi PS.
ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Cho 0,5 ml dung dịch acid hydrochloric 2/3 vào tất cả các tube, lắc đều. Cho 1 ml dung dịch kiềm - hydroxylamin vào các tube chứng và trắng. Cho 0,5ml dung dịch sắt (III) chloride 200mg/ml trong HCl 0.2 M vào tất cả các tube. Đo quang (OD) ở bƣớc sóng λ = 540 nm. Giá trị OD = OD (pƣ) - OD (ch).
10.7.2. Tính kết quả
- Vẽ đồ thị mối tƣơng quan giữa mật độ quang và nồng độ acetylcholine của đƣờng chuẩn theo hàmForecast trên máy tính. Tính nồng độ acetylcholine (µg) mẫu dựa vào đƣờng chuẩn.
+ Hàm lƣợng O-acetyl mẫu vắc xin Thƣơng hàn Vi PS tính theo công thức: acetylcholine (µg) x 0,5
O-acetyl (mol/liều) =
3 x 181,68
+ Hàm lƣợng O-acetyl mẫu kháng nguyên Vi PS đông khô qua cột tính theo công thức:
acetylcholine (µg) O-acetyl (g/ml) =
3
181,68 : khối lƣợng mol của phân tử acetylcholine
0,5 : 1 liều vắc xin 0,5 ml 3: chuyển về 1 ml
10.7.3. Tiêu chuẩn
Hàm lƣợng O-acetyl trong mẫu vắc xin Thƣơng hàn Vi PS đạt 0.085 ± 25% mol /liều (0.064 – 0.106 mol /liều).