CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5.1. Giới thiệu về kỹ thuật LAMP
So với các phương pháp chẩn đoán bệnh ở cá thông thường hiện nay chủ yếu dựa vào các dấu hiệu lâm sàng, phân lập và xác định tác nhân vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp vi sinh và hóa sinh hoặc sử dụng các kỹ thuật miễn dịch. Kỹ thuật PCR khuếch đại axit nucleic hiện đang rất phổ biến trong các phòng thí nghiệm với ưu điểm có thể phát hiện được tác nhân gây bệnh thông qua một lượng nhỏ ADN hoặc RNA. Đây được xem là kỹ thuật chính xác và nhạy nhưng lại thường đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp đi kèm và kỹ thuật viên thực hiện do đó việc ứng dụng phương pháp này ngoài thực địa bị hạn chế.
Một công cụ chẩn đoán phân tử mới được gọi là khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành các loop (LAMP) đã chứng minh được rằng: ADN có thể được khuếch đại ở điều kiện đẳng nhiệt mà không cần phải có chu trình nhiệt biến đổi như PCR [77]. Không giống như PCR, ADN đích sử dụng trong phương pháp này không cần phải biến tính để tách chuỗi [73], lượng sản phẩm phản ứng sau khi được khuếch đại với một thời gian rất ngắn lại rất lớn và các phản ứng dương tính có thể phát hiện được bằng mắt thường thay vì phải điện di như phương pháp PCR [57, 71]. Ưu điểm của phương pháp này là rất đơn giản, chỉ cần một bể ổn nhiệt hoặc một thiết bị gia nhiệt có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định là có thể tiến hành phản ứng.
Phương pháp LAMP sử dụng một ADN polymerase và 4 mồi được thiết kế đặc hiệu dựa trên 6 trình tự khác biệt trên gen đích. Mồi trong có trình tự tương tự và bổ sung với trình tự mạch LAMP khởi đầu. Cặp mồi ngoài có khả năng tách chuỗi phân tử
33
ADN cùng với sự hỗ trợ của Bst ADN polymerase có hoạt tính tách chuỗi cao tạo ra phân tử ADN mạch đơn. Sợi đơn này sau đó sẽ tạo thành cấu trúc dạng kẹp tóc tạo điều kiện khởi đầu cho phản ứng khuếch đại bởi LAMP.
Kỹ thuật LAMP có những ưu điểm mà kỹ thuật PCR không có được như [69]:
Không đòi hỏi máy biến nhiệt đắt tiền như PCR bởi vì tất cả phản ứng diễn ra tại một nhiệt độ cố định, dao động từ 60- 65oC, tùy thuộc vào hàm lương GC trong mồi.
Kết quả có thể được đọc ngay bằng mắt thường sau khi phản ứng kết thúc mà không cần điện di trên gel agarose.
Thời gian thực hiện phản ứng rất ngắn, trong vòng 60 phút với giới hạn phát hiện cao hơn kỹ thuật PCR.
Sự khuếch đại đặc hiệu cao vì có đến 2-3 cặp mồi nhận biết 6-8 vùng riêng biệt trên ADN khuôn.
Trong phương pháp LAMP lượng ADN tổng hợp được lớn hơn gấp nhiều lần so với PCR.
Phương pháp LAMP có thể thực hiện khuếch đại RNA bằng cách bổ sung thêm enzym phiên mã ngược vào trong hỗn hợp phản ứng.