CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5.3.Cơ chế khuếch đại của phản ứng LAMP
LAMP là phản ứng tự tách chuỗi và tự tổng hợp ADN ở nhiệt độ cố định từ 60- 65oC trong khoảng thời gian từ 45-60 phút với sự có mặt của Bst ADN polymerase, dNTPs, các cặp mồi đặc hiệu và sợi ADN khuôn. Có thể chia phản ứng LAMP thành 2 giai đoạn: Không theo chu kỳ và theo chu kỳ [69, 77].
Giai đoạn không theo chu kỳ tổng hợp cấu trúc khởi đầu sao chép:
Bước 1: Ở nhiệt độ khoảng 65oC, một trong số các mồi có thể tương tác với trình tự bổ sung trên ADN đích, khởi đầu quá trình sao chép ADN sử dụng ADN polymerase có hoạt tính tách chuỗi cao.
Bước 2: Ban đầu, mồi FIP bắt cặp với đoạn F2c trên sợi khuôn và khởi đầu quá trình tổng hợp sợi bổ sung từ đầu 3’ F2 của FIP tạo thành một sợi ADN kép có đầu F1c tự do không bổ sung với sợi khuôn
Bước 3: Mồi ngoài F3 bắt cặp với đoạn F3c trên sợi ADN khuôn, phía bên ngoài đoạn F2 và khởi đầu quá trình tổng hợp sợi bổ sung mới.
Bước 4-5: Một sợi ADN kép mới được tạo thành gồm sợi khuôn và sợi được tổng hợp bằng mồi F3, do đó giải phóng ra sợi bổ sung ban đầu được tổng hợp bằng mồi FIP có
36
trình tự F1 và F1c bổ sung với nhau nên tạo thành 1 loop ở đầu 5’ (5).
Bước 6: Sợi đơn (5) này đóng vai trò làm khuôn để tổng hợp sợi ADN mới bằng mồi BIP và sau đó tổng hợp sợi thay thế bằng mồi B3.
Ban đầu BIP có trình tự B2 bắt cặp bổ sung đoạn B2c ở đầu 3’ trên sợi đơn ADN khuôn và tổng hợp sợi bổ sung. Trong quá trình này sợi khuôn từ dạng vòng ở đầu 5’ trở lại thành dạng thẳng.
Mồi B3 bắt cặp với B3c phía ngoài BIP, dưới tác dụng của ADN pol tại đầu 3’ sợi ADN (được tổng hợp từ BIP) sẽ bị thay thế và giải phóng ở dạng sợi đơn.
Bước 7. Một sợi kép mới được tạo thành do sự bắt cặp bổ sung của sợ khuôn (5) với đoạn mới được tổng hợp bởi mồi B3 ở đầu 3’.
Bước 8: Sợi đơn liên kết với BIP sau khi được giải phóng ở bước 6 sẽ tạo thành 1 vòng ở đầu 5’ do sự bắt cặp bổ sung của B1 và B1c và 1 vòng ở đầu 3’ do sự bắt cặp bổ sung của F1 và F1c tạo thành cấu trúc giống hình quả tạ. Cấu trúc này là cấu trúc khởi đầu
37
Giai đoạn theo chu kỳ: tự mồi và kéo dài chuỗi
Bước 8-11: Cấu trúc ADN hình quả tạ (8) lúc này sẽ diễn ra 2 sự tự mồi để tổng hợp ra 2 sợi bổ sung với trình tự đích:
Một là: mồi FIP có trình tự F2 bổ sung với F2c sẽ bám vào loop bên trái tổng hợp 1 sợi bổ sung.
Hai là: mồi F1 ở đầu 3’ của (8) sẽ tự mồi tạo ra sợi bổ sung mới có đầu 3’ sẽ tạo thành loop mới do sự bắt cặp bổ sung của B1c và B1. Lúc này sợi ADN mới gồm có 2 sợi giống nhau cùng bổ sung với sợi đích (9). Do có B1 ở vị trí 3’ nên mồi B1 tiếp tục tự mồi tạo ra sợi ADN tương tự với sợi đích (8) và giải phóng sợi bổ sung do FIP tổng hợp ban đầu (11) có dạng quả tạ do sự bổ sung của F1-F1c và B1c-B1, trình tự của sợi khuôn 11 này bổ sung với sợi khuôn (8) ban đầu.
Tương tự vậy, sợi ở cấu trúc (11) sẽ được dùng làm khuôn để khởi đầu 2 quá trình tự mồi song song bằng mồi B1 ở đầu 3’ và mồi BIP bám vào đoạn B2c và bắt đầu sự tổng hợp ADN thay thế mạch, giải phóng đoạn ADN do B1 mồi. Theo đó, cấu trúc tương tư như ở bước (9) và (10) cũng như giống cấu trúc do bước (8) tạo thành. Với cấu trúc tạo thành ở bước (10), BIP bám vào đoạn mạch đơn B2c, sự tổng hợp ADN tiếp tục bởi sự thay thế đoạn mạch đôi ADN.
Kết quả của quá trình này là nhiều cấu trúc ADN kép bao gồm các trình tự lặp đi lặp lại luân phiên đảo ngược trình tự đích được ngăn cách với nhau bởi các loop trong cùng một sợi trên 1 phân tử AND kép (Hình 1.6).
38
Hình 1.6. Nguyên lý khuếch đại ADN của phản ứng LAMP [121]