CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5.4.3. Phát hiện dựa vào sản phẩm phụ của phản ứng
- Đo độ đục:
Phản ứng LAMP thực chất là quá trình tổng hợp ADN với hàm lượng lớn do đó sẽ tạo ra sản phẩm phụ của phản ứng là ion pyrophotphat P2O7- nên khi kết hợp với ion Mg2+ trong dung dịch phản ứng sẽ tạo thành kết tủa Mg2P2O7 làm cho hỗn hợp sau phản ứng bị đục. Lượng kết tủa này có thể quan sát được bằng mắt thường hoặc ly tâm hoặc thông qua đo độ đục ở bước sóng 400 nm [71]. Tuy nhiên, đây không phải là dấu hiệu rõ ràng nhất cho việc xác định phản ứng có xảy ra hay không.
- Sử dụng chỉ thị kim loại phát huỳnh quang:
Cũng do sự có mặt của ion pyrophotphat và sự tạo thành kết tủa của ion này với ion Mg2+ có trong thành phần phản ứng khuếch đại ADN, chỉ thị kim loại Calcein có thể được sử dụng để phát hiện phản ứng dương tính là [54, 117, 120].
Calcein có công thức hóa học C30H26N2O13 khối lượng phân tử 622,55 g/mol với tên quốc tế là 8- [N, N- Bis (carboxymethyl) aminomethyl]- 4-methylunbelliferone, có màu trắng hoặc màu vàng cam dạng bột. Calcein phát ra ánh sáng màu xanh huỳnh quang ở bước sóng 509 nm tại pH 7, nhưng không phát huỳnh quang ở pH 12 hoặc cao hơn. Sự phát huỳnh quang màu xanh của Calcein ở pH 4-11 được dập tắt bởi các ion kim loại như Co2+, Ni2+ và Cu 2 +, Fe3+ và Mn2+. Tuy nhiên, Calcein tạo thành một hợp chất phát huỳnh quang mạnh với các kim loại kiềm thổ thậm chí ở cả pH 12 hoặc cao hơn [122].
41
Calcein không độc hại như những thuốc thử huỳnh quang khác như SYBR Green, EtBr (do liên kết với ADN gây đột biến). Chỉ thị này có thể thay đổi sau phản ứng và có thể quan sát trực quan trực tiếp mà không cần mở nắp hoặc bất kỳ thiết bị phát hiện chuyên dụng nào [102]. Hỗn hợp Calcein và Mn2+ được thêm vào trước phản ứng. Do sự có mặt của ion Mn2+, Calcein liên kết với Mn2+ nên phản ứng phát huỳnh quang của Calcein bị dập tắt (không phát quang), dung dịch có màu da cam. Ion Mg2+ trong dung dịch phản ứng không thể đẩy được Mn2+ ra khỏi phức hợp để liên kết với Calcein khi không có ion P2O74-. Khi phản ứng khuếch đại ADN xảy ra với sự có mặt của ADN đích, Calcein bị tước mất ion Mn2+ bởi ion P2O74- tạo thành kết tủa MnP2O7, thay vào đó Calcein kết hợp với ion Mg2+ và phát quang (Hình 1.8). Dung dịch chuyển từ màu da cam ban đầu sang màu vàng chanh [102]. Các mẫu âm tính không có ADN đích vẫn giữ màu da cam.
Ngoài ra, có thể dùng các đầu dò ADN gắn huỳnh quang polyethylenimine [83] có phân tử lượng thấp để phát hiện sản phẩm phản ứng khuếch đại ADN. Sau khi được bổ sung vào sản phẩm phản ứng sẽ tạo thành phức không tan với ADN phát huỳnh quang có thể quan sát bằng mắt hoặc dưới ánh sáng UV [70].
Một loại chỉ thị màu nữa được sử dụng để phát hiện phản ứng khuếch đại ADN là HNB – Hydroxynapthol Blue cũng được nhiều tác giả sử dụng làm chỉ thị phát hiện phát ứng dựa vào sự thay đổi của màu từ đối chứng là tím sang màu xanh, tùy mức độ đổi màu từ xanh nhạt sang đậm có thể đánh giá được hàm lượng ADN được tạo ra là nhiều hay ít [47] [65].
42
Phức hợp ban đầu Calcein bị ức chế sự phát quang bởi Mn2+, khi phản ứng khuếch đại diễn ra, do sự tạo thành của muối kết tủa Mg2P2O7 đã kích thích Mn2+ đẩy Mg2+ khỏi muối, Mg2+ tự do trong dung dịch sẽ kết hợp với Calcein tự do tạo ra phức hợp Calcein-Mg phát quang.
Hình 1.9. Phát hiện phản ứng LAMP bằng đo độ đục, bằng huỳnh quang hoặc soi dưới đèn UV [121]