CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử
Một trong những phương pháp hữu hiệu có thể khắc phục những nhược điểm của các phương pháp truyền thống trong chẩn đoán đó là PCR. Ưu điểm của phương pháp là có độ chính xác và độ nhạy cao hơn trong việc chẩn đoán một tác nhân gây bệnh [19, 28, 29, 98, 99]. Cũng trên cơ sở đó, năm 2003 Bilodeau và cs đã dùng phương pháp Real-time PCR để phát hiện vi khuẩn E. ictaluri [27]. Phương pháp này có cùng nguyên lý với phương pháp PCR, cũng là phản ứng nhân bản các trình tự gen đặc hiệu nhưng có sử dụng chất phát huỳnh quang. Việc phát tín hiệu huỳnh quang được thực hiện ngay trong bước bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi. Năm 2005, Panangala và cs đã dùng phương pháp khuếch đại một đoạn trình tự dài 407 bp nằm giữa vùng 16S
(+) (-) (-)
30
và 23S rADN đặc trưng để phát hiện được đến chi Edwardsiella [80]. Phương pháp này hiện đang được dùng phổ biến tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ để phát hiện vi khuẩn E.ictaluri gây bệnh trên cá tại Việt Nam. Năm 2007, cũng lại chính Panangala và cs đã phát triển thêm một phương pháp multiplex-PCR để nhận diện bộ 3 vi khuẩn trong đó có E.ictaluri [79]. Đối với phương pháp miễn dịch học như phương pháp tạo kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFAT), phương pháp miễn dịch enzym (EIA) hoặc phương pháp miễn dịch liên kết enzym (ELISA) để xác định E. ictaluri. Các phương pháp trên là một trong những kỹ thuật miễn dịch để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hầu hết các phương pháp trên đều cho kết quả khả quan nhưng thao tác phức tạp, chi phí cao, thời gian thực hiện kéo dài, chưa đáp ứng được tính cấp bách của việc phát hiện E. ictaluri trên cá tra để kịp thời có biện pháp giải quyết, khắc phục dịch bệnh.
Năm 2000, Notomi và cs đã lần đầu tiên phát triển kỹ thuật LAMP: Loop- mediated isothermal amplifications, một phương pháp phát hiện dựa trên việc khuếch đại một trình tự ADN có sẵn trong điều kiện đẳng nhiệt [77]. Từ đó đến nay kỹ thuật này đã được nhiều tác giả trên thế giới ứng dụng để phát hiện rất nhiều loại vi khuẩn, virut, nấm và kí sinh trùng [81, 83]… trong đó có vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá nheo Mỹ I. punctatus [116]. Đây là một phương pháp mới, đơn giản, sử dụng hai cặp mồi được thiết kế đặc hiệu và thực hiện ở điều kiện đẳng nhiệt trong thời gian ngắn nhưng cho kết quả có độ chính xác cao. Kết quả của phản ứng có thể đọc nhanh bằng mắt thường nhờ phản ứng tạo màu huỳnh quang mà không cần điện di trên gel agarose. 1.5. KỸ THUẬT LAMP (Loop- Mediated Isothermal Amplifications)
Với mục đích ứng dụng một phương pháp mới, nhanh nhạy, đặc hiệu để chẩn đoán một tác nhân gây bệnh, chúng tôi nghiên cứu ứng dụng phương pháp LAMP của Notomi và cs nhằm phát hiện sự có mặt của vi khuẩn E. ictaluri ở cá tra P. hypophthalmus để từ đó có kết luận chính xác hơn về tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ hiện đang lưu hành tại Việt Nam, đồng thời là tiền đề cho các nghiên cứu chẩn
31
đoán các tác nhân gây bệnh khác trên động vật thủy sản, gia súc, gia cầm và trên người… nhằm góp phần đưa ra phương hướng điều trị tích cực và hiệu quả nhất.
LAMP là một phương pháp mới hiện đang được dùng phổ biến để chẩn đoán nhanh trong lĩnh vực y sinh học. LAMP có khả năng tổng hợp một lượng lớn AND mà không cần máy biến nhiệt. Phương pháp LAMP dựa vào quá trình tổng hợp ADN được thực hiện bởi một ADN polymerase đặc biệt và ít nhất hai cặp mồi đặc hiệu. Bước đầu tiên của quá trình khuếch đại, bốn mồi được sử dụng để tổng hợp khuôn cho phản ứng LAMP từ gen đích, sau đó hai mồi được sử dụng cho mỗi chu kỳ. Toàn bộ quá trình khuếch đại đoạn ADN đích cần thời gian khoảng 60 phút. Sản phẩm cuối cùng nhận được là các đoạn ADN kép dạng gấp khúc có kích thước gấp nhiều lần kích thước của đoạn gen cơ sở. Toàn bộ dung dịch sau phản ứng có thể quan sát được bằng mắt thường dưới sự thay đổi của các chỉ thị mà không cần điện di trên gel agarose. ADN polymerase thường được sử dụng trong các phản ứng LAMP là Bst ADN polymerase hoặc Bsm ADN polymerase có hoạt tính tự tách chuỗi cao. Do sử dụng 2-3 cặp mồi bắt cặp bổ sung với 6-8 đoạn trình tự trên gen đích nên phương pháp này có độ đặc hiệu và độ nhạy rất cao, có thể thu được kết quả tốt ngay ở nồng độ ADN thấp [73]. Oriel và cs năm 2010 đã công bố sử dụng phương pháp LAMP có thể phát hiện được gen rim và
p150 của vi khuẩnTheileria parva ở giới hạn 1 fg [78], còn Chen đã công bố có thể phát hiện được gen rimM của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis và
Mycobacterium bovis ở giới hạn là 1 pg [30]. Như vậy có thể thấy phương pháp LAMP có giới hạn phát hiện thấp hơn nhiều so với phương pháp PCR hoặc Real-time PCR nên có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác hơn so với các phương pháp sinh học phân tử khác. Tuy nhiên, mồi dùng cho phản ứng LAMP lại phức tạp hơn mồi cho phản ứng PCR thông thường. Phản ứng LAMP cần phải sử dụng hai cặp mồi, một cặp có chiều dài khoảng 40 nucleotit và được thiết kế đặc biệt, cặp còn lại có chiều dài khoảng 20 nucleotit [77].
32
Thêm vào đó, toàn bộ quá trình từ lúc khuếch đại gen đích và phát hiện sản phẩm phản ứng đều diễn ra trong 1 ống thí nghiệm ở điều kiện đẳng nhiệt. Ưu điểm của phương pháp này là có thể hạn chế sự nhiễm ADN ra khu vực xung quanh, điều mà phương pháp PCR không đảm bảo được do phải tiến hành điện di sản phẩm PCR và soi dưới máy UV. Như vậy, nếu sử dụng phương pháp LAMP thì không cần đến các thiết bị phòng thí nghiệm hiện đại và rất dễ dàng thao tác ở ngoài thực địa.