CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5.6. Các hướng nghiên cứu ứng dụng phương pháp LAMP tại Việt Nam
Có rất nhiều phương pháp chẩn đoán, phát hiện và xác định chính xác một tác nhân gây bệnh mà cho đến gần đây kỹ thuật nuôi cấy, xác định hình thái học bằng kính hiển vi quang học và gây bệnh thực nghiệm vẫn là những phương pháp cổ điển được ứng dụng. Những phương pháp mới, nhanh, nhạy, chính xác, kỹ thuật cao phần lớn là nhân bản và phát hiện ADN của tác nhân gây bệnh đã được phát triển và ứng dụng trong vòng 20 năm qua và hàng nghìn bộ kit chẩn đoán được thương mại hóa phát huy tác dụng hỗ trợ ở các cơ sở nghiên cứu và bệnh viện đã phần nào khẳng định lợi thế hơn hẳn của chẩn đoán phân tử khi kết hợp hoặc sử dụng riêng so với các phương pháp chẩn đoán thông thường khác.
Các phương pháp sử dụng ADN là chỉ thị phân tử như PCR, Nested-PCR, Multiplex-PCR và LAMP đã và đang được ứng dụng rộng rãi do tính tiện lợi và khả năng phát hiện, chẩn đoán chính xác đối tượng. Trong 10 năm trở lại đây kể từ khi Notomi công bố xây dựng thành công phương pháp LAMP, trên thế giới đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu chủ yếu là phát hiện các tác nhân gây bệnh bao gồm: nấm, virut, vi khuẩn, bào tử, kí sinh trùng… áp dụng phương pháp LAMP với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Xuất phát từ xu thế chung đó, tại Việt Nam trong một vài năm gần đây đã có một số tác giả ứng dụng phương pháp này trong chẩn đoán và phát hiện tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà chủ yếu là trên đối tượng virut. Năm 2009 nhóm nghiên cứu của Ths.Nguyễn Viết Dũng tại Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II đã tiến hành đề tài thuộc chương trình Công nghệ sinh học năm 2008-2009: “Xây dựng quy trình và bộ sinh phẩm phát hiện WSSV bằng phương pháp LAMP và thăm dò sự hiện diện của virut Laem Sing gây bệnh chậm lớn ở tôm nuôi khu vực Nam bộ”. Đề tài đã nghiên cứu thành công bộ kit sử dụng phương pháp LAMP cho phép phát hiện virut gây bệnh đốm
44
trắng -WSSV dựa vào gen đích vp28 trên mẫu tôm sú, tôm thẻ, tôm càng xanh bệnh. Bộ kit có thể phát hiện virut bệnh với số lượng 100 bản copy/phản ứng trong vòng 120 phút. Bộ kit của đề tài cũng đã gửi cho Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III và Chi cục Thủy sản Bình Thuận sử dụng thử và đã có nhận xét khá tốt về kết quả phát hiện bệnh của bộ kit [17].
Tiếp tục hướng nghiên cứu trên, năm 2010-2011 Ths. Nguyễn Viết Dũng đã tiến hành đề tài thứ 2 cũng thuộc chương trình Công nghệ sinh học: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán và chế tạo bộ kit phát hiện virut IMNV gây bệnh trên tôm Thẻ chân trắng (Liptopenaeus vannamei) và virut LSNV - gây bệnh trên tôm Sú (Penaeus monodon)” nhằm khảo sát và đánh giá sự hiện diện của virut IMNV- Infectious myoneccrosis virus gây bệnh đục cơ trên tôm thẻ và virut LSNV- Laem singh virus gây bệnh chậm lớn trên tôm sú và ứng dụng phương pháp RT-PCR và RT-LAMP chẩn đoán IMNV trên tôm thẻ chân trắng. Tuy nhiên, vì một số lý do đề tài đã xin dừng 2 hướng nghiên cứu là: Nghiên cứu, ứng dụng phương pháp RT-LAMP để chẩn đoán virut LSNV trên tôm sú và thiết kế đóng gói sản phẩm cho bộ kit RT-LAMP phát hiện virut LSNV và IMNV. Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường-Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã ra công văn đồng ý dừng một số nội dung trên.
Nhóm nghiên cứu thứ hai về phương pháp LAMP là nhóm nghiên cứu của tác giả Trương Quốc Phong – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội trên đối tượng là virut sử dụng phương pháp RT-LAMP (Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification) nhằm phát hiện đoạn ADN có kích thước 201 bp đặc hiệu genom Nucleoprotein N virut sởi của 10 chủng virut phân lập trong các vụ dịch sởi tại một số địa phương miền Nam Việt Nam trong năm 2008-2009. ARN genom virut sởi được tách chiết từ tế bào Vero Slam gây nhiễm virut sởi. Trong phương pháp RT-LAMP, phản ứng khuếch đại ADN được ủ ở duy nhất một nhiệt độ 63oC trong 60 phút. Quá trình thực hiện phản ứng đơn giản, diễn ra trong chỉ một tube và không đòi hỏi máy PCR. Bước đầu cho thấy phương pháp RT-LAMP là một phương pháp mới, đơn giản,
45
nhanh và nhạy trong phát hiện ADN genom virut sởi và bắt đầu được triển khai tại một số phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh virut [9].
Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm là môi trường thuận lợi cho các loại ký sinh trùng phát triển, gây bệnh, lây truyền giữa môi trường, động vật và người. Hơn nữa, mặt bằng vệ sinh đời sống chưa được đảm bảo, con người và động vật dễ nhiễm và tái nhiễm ký sinh trùng nguy hiểm nên việc nghiên cứu ứng dụng các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác có tầm quan trọng đặc biệt. Tuy chưa có công bố kết quả nghiên cứu ứng dụng LAMP đối với ký sinh trùng tại Việt Nam nhưng nhóm nghiên cứu của TS. Lê Thanh Hòa và cs thuộc Viện Công nghệ sinh học đã xây dựng xong phương pháp LAMP và đang thực hiện với một số loài sán lá gây bệnh thường gặp, sau đó tiến hành hoàn thiện Kit chẩn đoán LAMP để chuyển giao cho các cơ sở có nhu cầu. Bộ kit chẩn đoán phân tử và quy trình sử dụng cũng đang được xây dựng và hoàn thiện [5, 6].
Như vậy, các hướng nghiên cứu chẩn đoán phân tử bằng phương pháp LAMP đang dần được nghiên cứu, hoàn thiện và áp dụng tại Việt Nam. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào trên đối tượng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra Việt nam
Pangasius hypophthalmus. Đây được coi là hướng nghiên cứu mới đầu tiên sử dụng phương pháp LAMP trên đối tượng vi khuẩn gây bệnh cá ở Việt Nam. Chúng tôi hy vọng rằng, những kết quả đạt được trong khuôn khổ luận án này sẽ đóng góp một phần nhỏ bé vào định hướng công nghệ sinh học dùng trong chẩn đoán và phát hiện tác nhân gây bệnh và là cơ sở cho các nghiên cứu về LAMP trên nhiều đối tượng gây bệnh khác.
46