CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.4. Thiết kế và tổng hợp các cặp mồ
Mồi dùng cho nhân gen bằng kỹ thuật PCR: Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để nhân gen được thiết kế với một số điểm cần phải chú ý: trình tự mồi liên quan đến hiệu quả của quá trình nhân gen. Trình tự mồi phải có tỷ lệ Guanine/Cytosine cân đối, không nên có nhiều hơn 4 nucleotit cùng loại liên tiếp nhau. Nhiệt độ gắn mồi cần cao hơn 50oC để đảm bảo tính đặc hiệu của kỹ thuật PCR.
Mồi dùng cho nhân gen bằng kỹ thuật LAMP: khác với kỹ thuật PCR, LAMP là một kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt, nhanh, nhạy hơn so với PCR. Mồi dùng cho phản ứng nhân gen bằng kỹ thuật LAMP được thiết kế phức tạp hơn: gồm 4 mồi nhận biết 6 đoạn trình tự khác nhau của gen đích là F3c, F2c và F1c ở đầu 3’ và B3c, B2c, B1c ở đầu 5’ do đó kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao [77].
54
- 2 mồi trong kí hiệu là BIP và FIP, 2 mồi ngoài kí hiệu là B và F.
Mồi FIP: mồi trong xuôi, gồm 2 đoạn F1c ở đầu 5’ và F2 ở đầu 3’ nối với nhau bởi các dTTP, trong đó:
- F2 là trình tự bổ sung với đoạn F2c trên gen đích - F1c là trình tự của đoạn đoạn F1c trên gen đích
Mồi F3: mồi ngoài xuôi chứa đoạn F3 có trình tự bổ sung với đoạn F3c trên gen đích. Mồi BIP: mồi trong ngược gồm 2 đoạn B2 ở đầu 3’ và B1c ở đầu 5’ nối với nhau bởi các dTTP, trong đó:
- B2 là trình tự bổ sung với đoạn B2c trên gen đích - B1c là trình tự đoạn B1c trên gen đích
Mồi B3: mồi ngoài ngược chứa đoạn B3 bổ sung với đoạn B3c trên gen đích
Một số lưu ý khi thiết kế mồi LAMP:
- Khoảng cách giữa các đoạn trình tự từ đầu 5’ của F2 và B2 được thiết kế khoảng 120-180 bp, khoảng cách giữa 2 đoạn trong F2-F3 và B2-B3 từ 0 đến 20 bp. Khoảng cách trong vùng tạo loop (tính từ 5’-F2 đến 3’-F1, 5’-B2 đến 3’-B1) khoảng 40-60 bp.
- Tm khoảng 60-65oC trong trường hợp gen có tỷ lệ GC cao hoặc bình thường, khoảng 55-60oC trong trường hợp gen giàu AT.
- Tỷ lệ GC: khoảng 50-60% với gen có tỷ lệ GC cao và 40-50% với gen có tỷ lệ AT cao.
55
- Để tránh sự tạo thành cấu trúc bậc 2 của mồi thì trình tự đầu 3’ không được giàu AT và không bắt cặp bổ sung với trình tự các mồi khác.
- Nếu trên gen đích hoặc trên vùng chứa primer có vị trí cắt của enzym giới hạn thì có thể được sử dụng để xác định chính xác sản phẩm khuếch đại [69].