Các phương pháp vi sinh và hóa sinh

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Các phương pháp vi sinh và hóa sinh

Phân lập vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn tổng số: Các cơ quan nội tạng của cá như gan, thận và tỳ tạng được sử dụng để phân lập vi khuẩn E. ictaluri. Dùng panh và kéo mở khoang ngực cá để bộc lộ các cơ quan nội tạng. Dùng que cấy vô trùng cắm sâu vào từng bộ phận như gan, thận hoặc tỳ tạng rồi cấy ria lên đĩa chứa môi trường BHIA. Đĩa được ủ ở 28-30oC trong 48 giờ để tất cả các loại vi khuẩn phát triển.

Phân lập trên môi trường chọn lọc: Chọn các khuẩn lạc sáng bóng có kích thước nhỏ hơn 1 mm trên môi trường BHIA, cấy chuyển lên môi trường EIM. Chọn lọc các khuẩn lạc có màu xanh, tròn và kích thước khoảng 0,5 mm được dự đoán là vi khuẩn

E. ictaluri để thực hiện các kiểm tra sinh hóa tiếp theo.

Nuôi cấy và lưu trữ vi khuẩn

Môi trường nuôi cấy: các chất chọn lọc (bacitracin, tím kết tinh, colistin, muối mật) được lọc vô khuẩn và bổ sung vào môi trường khi nhiệt độ môi trường khoảng 500C. Môi trường nuôi cấy sau khi được khử trùng có thể giữ ở 4oC và dùng trong một tuần.

49

sinh chọn lọc trong trường hợp tách dòng) sang 5 ml môi trường lỏng nuôi cấy lắc 200 vòng/phút (v/p), 24 giờ ở 30oC với vi khuẩn E. ictaluri và 37oC đối với các vi khuẩn E. tarda và các vi khuẩn đối chứng.

Ghi chú: Khi nuôi cấy các chủng tái tổ hợp đều sử dụng môi trường có bổ sung ampicillin nồng độ cuối cùng là 50 g/ml như LBA (môi trường LB+ Ampicillin).

Cấy ria tạo khuẩn lạc đơn: nhúng que cấy vô trùng vào dung dịch nuôi cấy vi khuẩn, cấy ria trên đĩa petri chứa môi trường thạch, nuôi cấy ở nhiệt độ 30 hoặc 370C qua đêm, sau đó giữ ở 4oC và sử dụng trong vòng 15 ngày.

Giữ giống:bổ sung glycerol vô trùng vào dung dịch vi sinh đã nuôi cấy qua đêm sao cho nồng độ cuối cùng đạt 15%, giữ ống giống ở -80oC.

Các phương pháp hóa sinh

- Xác định khả năng di động, khả năng sinh indol và H2S

Chuẩn bị môi trường ống nghiệm để kiểm tra: 8 ml môi trường SIM được đổ vào các ống nghiệm 20 ml, đậy kín bằng nút bông và khủ trùng ướt. Sau khi khử trùng, các ống nghiệm được để theo phương thẳng đứng để định hình môi trường thạch trong ống nghiệm.

Cấy chủng để kiểm tra: Vi khuẩn được nuôi cấy trong ống nghiệm môi trường thạch đứng sao cho độ sâu của que cấy trong thạch khoảng 2 cm, ủ các ống nghiệm ở 30oC trong 24 giờ. Quan sát sự chuyển đổi màu của môi trường nuôi cấy sau mỗi 12 giờ nuôi cấy để kiểm tra các đặc điểm sau:

- Khả năng sinh H2S: Phản ứng dương tính tức là vi khuẩn có khả năng sinh H2S sẽ chuyển màu môi trường từ vàng sang đen do sự kết hợp của S2- với Fe2+ trong môi trường tạo thành FeS.

- Khả năng sinh Indol: Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Kovac (4-Dimetyl- aminobenzanldehyde 0,5%, ethanol 75 ml, HCl 25 ml, bảo quản 4oC) vào ống nghiệm, quan sát nếu thuốc thử chuyển sang màu đỏ là phản ứng dương tính, nếu vẫn giữ nguyên màu vàng là âm tính.

50

- Khả năng di động: Nếu vi khuẩn có khả năng di động sẽ lan ra môi trường thạch xung quanh vệt cấy và làm đục môi trường.

- Xác định hoạt tính tan huyết: Vi khuẩn được cấy ria hoặc cấy trải trên môi trường BHIA bổ sung 5% máu cừu để kiểm tra khả năng gây tan huyết. Đĩa được ủ ở 30oC trong 48 giờ để vi khuẩn phát triển. Quan sát đĩa trên ánh sáng trắng, phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng trong xung quanh khuẩn lạc (tan huyết ) hoặc xuất hiện màu sẫm quanh khuẩn lạc (tan huyết ).

- Xác định hoạt tính chondroitinase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Sử dụng môi trường BHIA bổ sung 400 g/ml BSA và chondroitin sulfate 1% [96]. Nhỏ 500 l dịch nuôi cấy sau 24 giờ vào mỗi giếng trên đĩa thạch, giữ ở 40C trong 2 giờ. Sau đó ủ ở 370C trong 12 giờ. Hiện vòng phân giải chondroitin bằng axit axetic 2N, nếu xuất hiện vòng trong xung quanh giếng thạch chứng tỏ chủng vi khuẩn có hoạt tính chondroitinase.

- Xác định hoạt tính catalase

Catalase là một enzym phổ biến tìm thấy ở hầu hết các sinh vật, có chức năng xúc tác phân hủy H2O2 tạo thành H2O và O2. Một phân tử catalase có thể phân hủy hàng triệu phân tử H2O2 trong một giây. Catalase là một tetramer của bốn chuỗi polypeptit, mỗi chuỗi có chiều dài hơn 500 axit amin, chứa bốn nhóm porphyrin heme [47] có khả năng phân giải H2O2. Giá trị pH tối ưu cho enzym catalase hoạt động thay đổi từ 4 tới 11 đối với catalase từ các sinh vật khác nhau. Nhiệt độ tối ưu cũng thay đổi khác nhau theo loài. Catalase cũng có thể oxy hóa các chất độc khác nhau chẳng hạn như fomaldehyt, axit fomic, phenol và rượu.

Cấy các mẫu vi khuẩn vào đĩa môi trường BHIA và đánh số thứ tự, sau đó ủ ở 30oC trong 24 đến 48 giờ. Nếu các chủng đã mọc thành khuẩn lạc thì kiểm tra hoạt tính catalase bằng cách nhỏ H2O2 3% lên trên bề mặt khuẩn lạc. Nếu thấy xuất hiện bọt khí chứng tỏ các chủng đều có enzym catalase phân hủy H2O2 thành H2O và O2

51