M E5/3 E5/4 E40/3 Ei/10 ĐC
6: E.ictaluri ATTC 3
3.5.2.2. Ảnh hưởng thời gian phản ứng
Trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh thì thời gian chẩn đoán đóng vai trò hết sức quan trọng trong điều trị. Một số phương pháp phát hiện thường dùng trong phòng thí nghiệm như phương pháp vi sinh (cần 4 đến 7 ngày), phương pháp PCR truyền thống (khoảng 180 phút).
Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng thời gian cần thiết cho phản ứng LAMP cho kết quả tốt là dưới 60 phút [56, 92]. Tùy từng bộ mồi, gen được sử dụng mà thời gian thích hợp cho phản ứng diễn ra là khác nhau. Savan đã khuếch đại được gen mã hóa hoạt tính tan huyết của vi khuẩn E. tarda bằng phương pháp LAMP với thời gian phản ứng ít nhất là 45 phút và ở nhiệt độ trên 65oC. Phản ứng LAMP khuếch đại gen
eip18 được tiến hành trong khoảng thời gian từ 20 đến 65 phút (Hình 3.27). Kết quả thu được cho thấy rằng sau 30 phút phản ứng thì sản phẩm LAMP đã có dấu hiệu được khuếch đại để có thể quan sát bằng điện di tuy chưa rõ ràng, sắc nét. Phải sau thời điểm 35 phút mới có thể quan sát được sản phẩm ADN trên gel điện di và giá trị OD400 đã xác định được ở tại thời điểm này. Thời gian phản ứng càng kéo dài thì giá trị OD400 càng lớn đồng nghĩa với việc ADN được khuếch đại với hàm lượng rất lớn theo thời
0.00.2 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 47 49 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 OD400 100 47 49 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 M T oC oC A B 500 bp
99
gian. Kết quả kiểm tra bằng đo OD400 cho thấy hoàn toàn phù hợp với sản phẩm điện di trên gel agarose.
Hình 3.27. Ảnh hưởng của thời gian tới phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18 của mẫu vi khuẩn
E. ictaluri E7; M: 100 bp ADN marker. (-) đối chứng âm không có ADN
Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng có bài báo công bố thời gian khuếch đại của phản ứng LAMP có thể rất nhanh, chỉ sau một thời gian phản ứng rất ngắn khoảng 15 phút một đoạn gen psa mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt kích thước 569 bp cũng đã bắt đầu có sự khuếch đại ADN bằng phương pháp LAMP [71].