CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5.4.2.Phát hiện dựa vào chất phát huỳnh quang
Sản phẩm của phản ứng LAMP là ADN dạng mạch kép cho nên có thể được phát hiện bằng cách nhuộm trực tiếp ADN sợi đôi với các thuốc nhuộm như SYBR Green, SYTO- 9….SYBR Green là một thuốc nhuộm cyanine bất đối xứng được sử dụng như là một chất nhuộm axit nucleic trong sinh học phân tử. Nó được dùng trong kĩ thuật real-time PCR và cũng để nhuộm ADN trong điện di thay cho EtBr. SYBR Green liên kết với ADN hình thành phức hợp ADN- thuốc nhuộm hấp thụ ánh sáng màu xanh (λmax = 488 nm) và phát ra ánh sáng màu xanh lá cây (λmax = 522 nm). SYBR Green ưu tiên gắn với ADN sợi đôi và vẫn liên kết với ADN sợi đơn nhưng với hiệu suất thấp hơn. Nguyên tắc nhuộm của SYBR Green là khi chèn vào sợi đôi ADN sẽ phát huỳnh quang, số lượng ADN sợi đôi càng nhiều thì tín hiệu huỳnh quang phát ra càng cao [59].
Tuy nhiên, đối với phản ứng LAMP vì diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt nên khi bổ sung SYBR Green ngay từ đầu tương tự như Real-time PCR thì do đặc tính liên kết chặt với ADN đôi nên có thể gây ức chế phản ứng, nhưng nếu mở nắp để thêm SYBR vào sau khi phản ứng kết thúc lại gây ra nguy cơ ô nhiễm không gian làm việc bởi sản
Quá trình khuếch đại
Điện di trên gel agarose Quan sát dưới tia UV
40
phẩm khuếch đại. Ngoài SYBR Green I được xem là một trong những hoạt chất dễ phát hiện phản ứng nhất, nhanh, nhạy và chính xác nhất được nhiều tác giả sử dụng [76, 115] thì còn có các chất hiện màu khác như Picogreen I [39], SYBR Gold hoặc EvaGreen [84]…Do đó, để khắc phục nguy cơ này thì cần thiết phải thiết kế một hệ phản ứng đóng, trong đó chất chỉ thị được đưa vào trước phản ứng nhưng lại không ảnh hưởng đến phản ứng và có thể thay đổi màu sắc sau phản ứng để dễ dàng quan sát bằng mắt thường.