CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5.2. Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng LAMP
Phản ứng LAMP muốn hoạt động cần có sự tham gia của 2 cặp mồi: một cặp mồi ngoài và một cặp mồi trong. Cả 4 mồi này ban đầu đều được sử dụng để tạo sợi khởi đầu cho phản ứng LAMP. Sau đó, cặp mồi trong được sử dụng cho phản ứng khuếch đại ADN. Cặp mồi ngoài được gọi là F3 và B3 và cặp mồi trong được gọi là: mồi xuôi trong FIP và mồi ngược trong BIP. Bộ 4 mồi được thiết kế dựa trên 6 vùng khác nhau của ADN đích: Vùng F3c, F2c, F1c ở đầu 3’ và Vùng B1, B2, B3 ở đầu 5’.
34
Hình 1.5. Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP [121]
FIP: Forward inner primer chứa vùng F2 ( ở đầu 3’) liên kết bổ sung với vùng F2c trên ADN được nối với 1 trình tự tương tự F1c ở đầu 5’.
F3: Forward outer primer chứa trình tự F3 bổ sung với F3c trên ADN
BIP: Backward inner primer chứa vùng B2 (3’) bổ sung với B2c trên ADN nối với 1 trình tự tương tự B1c ở đầu 5’
B3: Backward outer primer chứa trình tự B3 bổ sung với B3c trên ADN
Cả 2 mồi trong đều gồm 2 đoạn trình tự khác nhau bổ sung với sợi khuôn và sợi đối khuôn trên phân tử ADN đích, trong đó 1 trình tự dùng cho giai đoạn khởi đầu chu kỳ khuếch đại và một trình tự dùng cho quá trình tự mồi. Việc sử dụng thêm một bộ 2 mồi tạo loop, mồi loop xuôi (LF) và mồi loop ngược (LB) có thể làm tăng hiệu quả của phản ứng LAMP. Nhiệt độ Tm của mồi F1c và B1c thường phải cao hơn so với mồi F2 và B2 để có thể tạo được cấu trúc loop. Nhiệt độ Tm của mồi ngoài F3 và B3 thì lại phải thấp hơn so với mồi B2 và F2 để đảm bảo rằng mồi trong có thể bắt đầu quá trình tổng hợp sớm hơn so với các mồi ngoài. Thêm vào đó, nồng độ của các mồi trong bao giờ cũng phải cao hơn so với các mồi ngoài. Nồng độ mồi ngoài chỉ nên bằng ¼ đến 1/10 nồng độ mồi trong [77, 83, 84]. Đây là điểm mấu chốt để phản ứng LAMP có thể tạo thành cấu trúc khởi đầu sao chép dạng quả tạ.
Kích thước của các vòng loop được tạo thành giữa F2c và F1c cũng như giữa B2c và B1c thích hợp nhất là khoảng 40 nucleotit hoặc dài hơn. Kích thước của gen đích cũng có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả của phản ứng bởi đây là quá trình tự sao chép ADN.
35