M E5/3 E5/4 E40/3 Ei/10 ĐC
3.4.1. Thí nghiệm cảm nhiễm mẫu vi khuẩn E.ictaluri E
Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm bởi vi khuẩn E. ictaluri E5
Kết quả cho thấy cá bắt đầu chết vào ngày thứ 3 ở công thức 107 với tỷ lệ 13,3% và 102 là 3,3%. Vào ngày thứ 4 tất cả các công thức đều có cá chết trừ bể đối chứng.
0%20% 20% 40% 60% 80% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CT 10^7 CT 10^6 CT 10^5 CT 10^4 CT 10^3 CT 10^2 CT NaCl Không tiêm Tỷ lệ cá chêt (%) Ngày cảm nhiễm
87
Sau 12 ngày thí nghiệm ở CT 107 cá chết với tỷ lệ cao nhất 83,3% và thấp nhất là 26,7% với công thức 102. Các CT khác đều có cá chết với tỷ lệ là 66,7%, 53,3%, 43,3% và 36,7% tương ứng với CT 106, 105, 104 và 103, riêng với CT tiêm nước muối sinh lý cũng có cá chết nhưng tỷ lệ không cao 10%, bể không tiêm thì ko có cá cá chết.
LD50 của vi khuẩn E. ictaluri E5 thu được là 104,7 CFU/ml (Hình 3.18)
3.4.2. Thí nghiệm cảm nhiễm mẫu vi khuẩn E. ictaluri E7
Đối với vi khuẩn E. ictaluri E7, sau khi gây cảm nhiễm cho kết quả rất tốt. Các CT khác nhau cho tỷ lệ chết khác nhau, ở các CT 107, 106, 105 cá bắt đầu chết sau 4 ngày cảm nhiễm, còn CT 104 cá chết sau 5 ngày cảm nhiễm, ở CT 103 và 102 cá chết lần lượt vào ngày thứ 5 và 6. Sau 12 ngày cảm nhiễm ở CT 107 cá chết 100% và thấp nhất ở CT 102 với 6,7%. CT 105 và 106 cá chết 93,3%, CT 103 và 104 lần lượt là 63,3 và 73,3%. Các CT đối chứng đều không xuất hiện cá chết.
Hình 3.19. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm bởi vi khuẩn E. ictaluri E7
Trong trường hợp cảm nhiễm với mẫu vi khuẩn E7 có sự giảm tỷ lệ cá chết chênh lệch ở công thức tiêm 103 xuống 102 (từ 63,3% xuống 6,7%) nên cần bố trí thí nghiệm với liều pha loãng trong khoảng 102 đến 103 để xác định chính xác hơn nữa giá
0%20% 20% 40% 60% 80% 100% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CT 10^7 CT 10^6 CT 10^5 CT 10^4 CT 10^3 CT 10^2 CT NaCl Không tiêm Ngày cảm nhiễm Tỷ lệ cá chết
88
trị LD50. Ước tính theo số liệu thu được thì LD50 của vi khuẩn E7 thu được là 102,8 CFU/ml cho thấy mẫu vi khuẩn E7 có độc lực khá mạnh. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.19.
3.4.3. Thí nghiệm cảm nhiễm mẫu vi khuẩn E. ictaluri E40
Sau 12 ngày cảm nhiễm bởi vi khuẩnE. ictaluri E40 ở CT 107 cá chết với tỷ lệ 93,3%, ở CT 106 là 80% và 105 là 60%, 104 là 33,3%. Riêng CT 103 tỷ lệ cá chết thấp (16,7%) hơn so với CT 102 (20%). Tuy nhiên sự chênh lệch này không cao, có thể chấp nhận được. Sau khi cảm nhiễm cá chết vào ngày thứ 3 và 4. Các bể đối chứng đều không có cá chết. LD50 của vi khuẩn này là 103,7 CFU/ml, độc lực cũng tương đối mạnh so với trường hợp cảm nhiễm cá bằng mẫu vi khuẩn E. ictaluri E5.
Hình 3.20. Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm bởi vi khuẩn E. ictaluri E40
Bảng 3.5. LD50 của các mẫu vi khuẩn cảm nhiễm vào cá tra giống P. hypophthalmus
Tỷ lệ % cá chết Mẫu cảm nhiễm
Mật độ vi khuẩn (CFU/ml), liều tiêm 100 l/liều
LD50107 106 105 104 103 102 NaCl KT 107 106 105 104 103 102 NaCl KT E5 83,3 66,7 53,3 43,3 36,7 26,7 10 0 104,7 E7 100 93,3 93,3 73,3 63,3 6,7 0 0 102,8 E40 93,3 80 60 33,3 16,7 20 0 0 103,7 0% 20% 40% 60% 80% 100% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CT 10^7 CT 10^6 CT 10^5 CT 10^4 CT 10^3 CT 10^2 CT NaCl Không tiêm Ngày cảm nhiễm Tỷ lệ cá chết
89
Như vậy:
- Sau khi gây cảm nhiễm bởi các mẫu vi khuẩn E. ictaluri ở các nồng độ cảm nhiễm khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh khác nhau. Hầu hết cá được cảm nhiễm bởi các mẫu vi khuẩn phân lập ở Việt Nam đều bắt đầu chết sau 2 đến 4 ngày cảm nhiễm ở các nồng độ vi khuẩn từ 106 đến 107. Theo số liệu nghiên cứu của nhóm các nhà khoa học tại Đại học Cần Thơ mà người đứng đầu là PGS. TS. Đặng Thị Hoàng Oanh cho thấy (số liệu riêng) khi cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra giống cá bắt đầu chết từ ngày thứ 2 ở mật độ 106đến 108. Williams (2005) khi tiến hành cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri chủng dại và chủng đột biến gen hemolysin vào xoang bụng cá nheo Mỹ được cung cấp bởi Ủy ban chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm, trường Đại học Mississippi cho kết quả chủng R4383 WT ở mật độ 5,2x103 cfu/ml, 5,2x104 cfu/ml, 5,2x105 cfu/ml thì tỉ lệ chết lần lượt là 67,2%, 100%, 100%. Trong khi đó chủng đột biến R4383 HM là 63,5%, 98,7% và 100%. Đối với trường hợp cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm ở nồng độ 107 CFU/bể thì không có sự khác biệt rõ ràng [113]. Newton với thí nghiệm cảm nhiễm bằng cách ngâm cá trong nước có vi khuẩn ở mật độ 5x108 CFU/ml thì sau 10 ngày, cá chết với tỷ lệ 93% [74]. Năm 2009 Nguyễn Hữu Thịnh tiến hành so sánh hai phương pháp cảm nhiễm khác nhau là tiêm 0,1 ml vào xoang bụng và ngâm cá với vi khuẩn E. ictaluri từ nồng độ 5,5x103 đến 5,5x106. Sau 14 ngày theo dõi liên tục cho thấy: đối với phương pháp ngâm, tỷ lệ cá chết thay đổi từ 1,3% ở nồng độ vi khuẩn cuối cùng là 5,5x103 cfu/ml đến 66% ở nồng độ 5,5x106 CFU/ml. Với liều ngâm >106 thì đã đủ hiệu lực gây chết cá. Bằng phương pháp tiêm thì tỷ lệ cá chết cao hơn, dao động từ 93% đến 99% [100]. Theo nghiên cứu mới đây nhất của Từ Thanh Dung và cs tại Đại học Cần Thơ năm 2012 khi cảm nhiễm 2 chủng vi khuẩn E. ictaluri HO2 và 223 đều phân lập được từ cá có biểu hiện gan thận mủ tại An Giang cho thấy: chủng HO2 có độc lực mạnh hơn hẳn, dấu hiệu bệnh lý sớm nhất xuất hiện 4 giờ sau cảm nhiễm trong khi đó cá cảm nhiễm bởi chủng 223 không xuất hiện dấu hiệu bệnh cũng như không chết, số lượng vi khuẩn
90
tái phân lập lại từ mang, gan, thận, tỳ tạng đều thấp hơn so với trường hợp của chủng HO2 [40].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng thời điểm biểu hiện bệnh ở các chủng khác nhau là khác nhau và nồng độ cảm nhiễm cũng ảnh hưởng đến thời gian biểu hiện cũng như tỷ lệ chết của cá. Ngoài thời điểm xuất hiện bệnh thì tỷ lệ cá chết cũng phản ánh khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Sau khi theo dõi 12 ngày ở những lô cá được cảm nhiễm bằng mẫu vi khuẩn E5 cá chết với tỷ lệ cao (83%) tương ứng với nồng độ cảm nhiễm 0,4x107 cfu/ml và thấp nhất 26,7% (0,4x102 cfu/ml). Mẫu vi khuẩn E7 ở nồng độ 0,8x107 cfu/ml cá chết với tỷ lệ cao nhất 100% và thấp nhất là 6,7% (0,8x102 cfu/ml). Mẫu vi khuẩn E40 tỷ lệ chết cao nhất đạt 93% (0,5x107 cfu) và thấp nhất 7% với mật độ 0,5x103 cfu/ml.
Các mẫu vi khuẩn thí nghiệm khác nhau thì độc lực cũng khác nhau dựa vào giá trị LD50. Trong 3 mẫu cảm nhiễm thì mẫu vi khuẩn E7 có giá trị LD50 thấp nhất là 102,8 cfu/ml, mẫu E5 có LD50 cao nhất là 104,7 cfu/ml và E40 cũng có độc lực tương đối mạnh với giá trị LD50 là 103,7 cfu/ml. Lawrence năm 1997 sử dụng 2 dòng vi khuẩn là LSU-E2 giảm độc lực thu được LD50 là 5,1x107 cfu/ml trong khi đó chủng tự nhiên không xác định được LD50 do ở nồng độ cảm nhiễm thấp nhất 1,3x102 cfu/ml đã có hơn 50% cá bị chết [63]. Baxa và cs năm 1990 cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp ngâm trên cá hồi trắng và theo dõi trong 12 ngày đã ghi nhận được giá trị LD50 là 3,4x107 cfu/ml [26].
Như vậy, khả năng gây bệnh trên cá tra của các chủng vi khuẩn khác nhau phụ thuộc vào độc lực của từng chủng và tùy thuộc vào nhiều điều kiện ngoại cảnh khác. Trong thí nghiệm này, khi cảm nhiễm cá tra bằng mẫu vi khuẩn E5 thấy bể đối chứng có xuất hiện cá chết chiếm 10%. Còn đối với mẫu vi khuẩn E40, ở nồng độ cảm nhiễm thấp tỷ lệ cá chết cao hơn so với nồng độ cảm nhiễm cao. Ví dụ: nồng độ 0,5x102 cfu/ml tỷ lệ chết là 20% cao hơn so với nồng độ 0,5x103 cfu/ml (16,7%). Điều này có thể là do hiện tượng cá bị shock khi tiêm vì bể đối chứng cá không bị tiêm thì hoàn
91
toàn không có cá chết. Francis-Floyed (1996) đã chứng minh được rằng, khi gây cảm nhiễm trên cá này ở nhiệt độ 25oC cá chết nhiều nhất, chết thấp nhất ở 23 và 28oC và không chết ở các nhiệt độ 17 và 32oC [45]. Còn đối với mẫu vi khuẩn E7 có sự giảm mạnh tỷ lệ chết khi giảm nồng độ cảm nhiễm từ 103 xuống 102 nên cần bố trí lại công thức tiêm với các nồng độ vi khuẩn pha loãng chia nhỏ hơn trong khoảng 102 và 103 và lặp lại thí nghiệm tăng lên để xác định chính xác LD50 của mẫu vi khuẩn này.
3.4.4. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm bởi vi khuẩn E. ictaluri
Dấu hiệu bệnh lý của cá gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri giống như dấu hiệu bệnh lý của cá nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ngoài tự nhiên (Hình 3.21A) và khác hoàn toàn so với cá khỏe mạnh (Hình 3.21C). Sau khi được cảm nhiễm cá có biểu hiện bơi lờ đờ, nổi đầu, bỏ ăn sau đó chết. Biểu hiện ngoài da cá nhợt nhạt, một số có xuất huyết ở vây và hậu môn. Giải phẫu bên trong một số cơ quan nội tạng như gan, thận, tỳ tạng thấy xuất hiện nhiều đốm trắng, nhỏ, đường kính 1-2,5 mm, một số có hiện tượng phù nhũn thận, nội tạng tái nhạt và có thể có dịch màu trắng (Hình 3.21B). Các dấu hiệu bệnh lý này cũng tương tự công bố của Nguyễn Quốc Thịnh năm 2003 [13], Crummish năm 2010 [34] và Từ Thanh Dung năm 2012 [40].
A B C
Hình 3.21. Đốm trắng trên nội quan cá tra. A - Cá thu ở ao nuôi thâm canh; B - Cá được gây cảm
nhiễm bởi vi khuẩn E. ictaluri trong phòng thí nghiệm và C - Cá khỏe mạnh.
Gan là cơ qua tiết ra dịch mật, đổ vào túi mật và ruột non qua ống dẫn mật và còn là nơi giải độc cho cơ thể đồng thời thực hiện việc chuyển hóa gluxit, lipit, protein trong cơ thể. Quan sát mô gan của cá sau cảm nhiễm thấy có nhiều biển đổi, điển hình
92
là liên kết cấu trúc tế bào gan bị phá hủy, đảo tụy và tĩnh mạch gan xung huyết, nhiều vùng tế bào có biểu hiện xuất huyết, biến đổi cấu trúc và hoại tử hạt (Hình 3.22 A,B). Tổn thương trên toàn bộ tổ chức gan làm giảm chức năng khử độc, lọc máu, chuyển hóa vật chất và tiết mật cho cơ thể. Việc không loại bỏ được chất độc khỏi cơ thể là một trong những nguyên nhân làm cho cá chết.
Thận là cơ quan bài tiết và tạo máu, là con đường xâm nhập chủ yếu của vi khuẩn. Quan sát mô thận cá (Hình 3.22 C,D) cho thấy cấu trúc ống thận bị vỡ, nhiều vùng bị hoại tử, quản cầu thận mất cấu trúc dẫn đến mất chức năng bài tiết trong quá trình trao đổi chất gây tích tụ các chất độc trong cơ thể.
Hình 3.22. Đặc điểm mô bệnh học của cá tra gây cảm nhiễm bởi vi khuẩn E . ictaluri. A. Xung huyết
tĩnh mạch trung tâm, xuất huyết nhiều vùng trên gan. B. Vùng tế bào gan bị biến đổi cấu trúc. C. a. Quản cầu thận bị xung huyết, b. Ống thận bị họai tử, mất cấu trúc. D. Thận bị xung huyết và xuất
93
Hiện tượng xung huyết kéo dài sẽ làm vỡ mạch máu nội tạng, giải thoát nhiều enzym tiêu hóa thu hút bạch cầu làm cho các tổ chức viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử. Những thay đổi về cấu trúc và hiện tượng sung huyết hay xuất huyết ở các mô gan, thận và tỳ tạng của cá tra bị bệnh gan thận mủ giống như mô tả của Ferguson (2001) và Nguyễn Quốc Thịnh (2003) [13, 43].
Theo kết quả cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri chủng HO2 sau 72 giờ cảm nhiễm đã xuất hiện các tổn thương dạng hoại tử ở gan, thận, và tỳ tạng những cá bị chết, nhuộm Giemsa vùng tế bào tổn thương có xuất hiện các nhóm tế bào hình que ngắn mà không tìm thấy ở các mẫu đối chứng và mẫu bệnh phẩm cá được cảm nhiễm bởi chủng 223 [40].