M E5/3 E5/4 E40/3 Ei/10 ĐC
6: E.ictaluri ATTC 3
3.5.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+
Nồng độ ADN sau khi được khuếch đại bằng phương pháp LAMP cao hơn nhiều lần so với các phương pháp khuếch đại thông thường khác như PCR hoặc RT- PCR, do đó một trong những khuyến cáo đối với việc áp dụng phương pháp LAMP là tuyệt đối tuân thủ các chỉ dẫn để trách sự lây nhiễm ADN trong phòng thí nghiệm. Vì
500 200 200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M 500 200
102
vậy, việc phát hiện phản ứng bằng mắt thường tỏ ra phù hợp hơn cả. Theo Saiki và cs (1998) thì ion Mg2+ tự do có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ gắn mồi và hoạt tính của ADN polymerase [89] và để tránh sự lây nhiễm ADN sau phản ứng, một loại chỉ thị kim loại được dùng để để phát hiện sự có mặt của ion Mg2+ trong phản ứng LAMP. Phản ứng được tiến hành tương tự như trên nhưng được bổ sung 1 l Calcein 1,25 mM.
Hình 3.30. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 đến phản ứng LAMP. M: marker 100 bp; 1-2: 0 mM
MgSO4; 3-4: 1 mM MgSO4; 5-6: 2 mM MgSO4; 7-8: 3 mM MgSO4; 9-10: 4 mM MgSO4; 11-12: 5 mM MgSO4; 13-14: 6 mM MgSO4; 15-16: 7 mM MgSO4; 17-18: 8 mM MgSO4; 19-20: 9 mM MgSO4;
21-22: 10 mM MgSO4. Các đường chạy chẵn là đối chứng không có ADN.
CMg2+ 0mM 1mM 2mM 3mM 4mM
(+)/(-)
5mM 6mM 7mM 8mM 9mM 10mM
Hình 3.31. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 đến sự phát quang của Calcein
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M 17 18 19 20 21 22
1000 500 500
100 bp bp
103
Kết quả thu được khi thực hiện phản ứng LAMP với nồng độ ion Mg2+ khác nhau thì tại nồng độ 4 mM (đường chạy số 9) đã khuếch đại được gen đích (Hình 3.30). Ở những nồng độ Mg2+ cao hơn thì hàm lượng ADN được khuếch đại cũng không thay đổi so với nồng độ 4 mM thể hiện ở giá trị OD400 không có sự khác biệt (Hình 3.32) và sự đổi màu của chỉ thị Calcein rất rõ ràng bắt đầu từ nồng độ Mg2+ này (Hình 3.31). Vì vậy, nồng độ Mg2+ ban đầu là 4 mM được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với công bố của Kuboki (2003) và Notomi và cs (2000) [69, 82].
Hình 3.32. Giá trị OD400 tương ứng với các nồng độ MgSO4 khác nhau
Các nghiên cứu khác nhau liên quan đến LAMP về ảnh hưởng của nồng độ ion Mg2+ đến phản ứng cho thấy: tùy độ dài của mồi, độ dài của gen đích mà lượng Mg2+ tối ưu được bổ sung vào có thể khác nhau. Nghiên cứu của Yeh và cs năm 2005 chỉ ra rằng lượng Mg2+ tối ưu là 6 mM, tương tự công bố của Qiao khi nhân gen gag bằng phản ứng LAMP để xác định sự có mặt của bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis trong các nhóm thực phẩm chứa tinh bột [84]. Nhiều nghiên cứu khác về LAMP cũng chỉ ra rằng giới hạn nồng độ Mg2+ tối ưu là từ 4 mM đến 8 mM [62, 77]. Khi quan sát dưới tia UV thì sự khác biệt giữa phản ứng dương tính và âm tính cũng rất rõ ràng như Hình 3.33. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10 20 30 40 50 60 0mM 1mM 2mM 3mM 4mM 5mM 6mM 7mM OD400 Thời gian (phút)
104
Hình 3.33. Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP bằng chỉ thị Calcein dưới tia UV trong điều kiện
phòng có chiếu sáng (A) và trong buồng tối (B). E.t - sản phẩm LAMP khuếch đại genom của vi khuẩn
E. tarda; E7 – Sản phẩm LAMP khuếch đại từ genom vi khuẩn E. ictaluri E7.
Như vậy, phản ứng LAMP với chỉ thị Calcein có thể khuếch đại AND sau 35 phút phản ứng ở 55 đến 69oC, nồng độ dNTP 0,5 mM, tỷ lệ mồi B3F3 và BIF, FIP thấp nhất là 1:2, nồng độ Betain là 0,1 M.
Trong trường hợp sử dụng các chất phát hiện khác như SYBR Green I hoặc các chất tương tự thì nồng độ các thành phần phản ứng không ảnh hưởng đến sự phát quang của chất chỉ thị. SYBR Green I được bổ sung vào sau khi kết thúc phản ứng. Về nguyên tắc SYBR có khả năng bắt cặp với các ADN sợi đôi nên việc tồn tại ADN được khuếch đại sẽ làm cho SYBR chuyển từ màu vàng cam sang màu xanh.
Hình 3.34. Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP bằng chỉ thị SYBR Green I. E.t – Sản phẩm LAMP
khuếch đại từ genom vi khuẩn E. tarda; E.i – Sản phẩm LAMP khuếch đại từ genom vi khuẩn E. ictaluri ATCC33202 và E7 – sản phẩm LAMP khuếch đại từ genom vi khuẩn E. ictaluri phân lập tại Việt
Nam kí hiệu E7.
Kết quả thu được rất rõ ràng như Hình 3.34 cho thấy: do nồng độ ADN sau khi được khuếch đại bằng phương pháp LAMP cao hơn nhiều lần so với các phương pháp
Et Ei E7 E.t E7
A B
105
khuếch đại thông thường khác như PCR hoặc RT-PCR nên dấu hiệu chuyển màu rất rõ ràng. Nếu phản ứng dương tính, dung dịch phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh sáng, ngược lại vẫn giữ nguyên màu cam. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là với hàm lượng ADN lớn được khuếch đại sau phản ứng thì việc lây nhiễm là điều có thể xảy ra với bất cứ phòng thí nghiệm nào. Do đó, để tránh việc lây nhiễm và thuận lợi trong việc ứng dụng ngoài thực tế, có giá trị về mặt kinh tế thì Calcein đáp ứng được các tiêu trí trên hơn là SYBR Green I.