W: weak – vi khuẩn phát triển yếu, khuẩn lạc kích thước nhỏ 0,1 mm sau 48 giờ nuôi cấy
3.3.1. Phân lập gen eip
Sử dụng ADN genom và cặp mồi được thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự gen
eip18, chúng tôi tiến hành PCR thu được sản phẩm như hình 3.13.
Hình 3.13. Phân lập gen eip18 từ vi khuẩn E. ictaluri. M: thang ADN 100 bp chuẩn; 1-2-3: Sản phẩm
PCR từ genom mẫu vi khuẩn E5, E40 và E. ictaluri ATCC33202; 4- Sản phẩm PCR từ genom vi khuẩn E. tarda ATCC14569
Về mặt lý thuyết, gen eip18 là gen đặc trưng của vi khuẩn E. ictaluri. Đoạn gen này có kích thước khoảng 480 bp và không có các trình tự tương đồng với các gen ở các vi khuẩn thuộc cùng họ Enterobacteriaeace cũng như các vi khuẩn khác, ngoại trừ với gen evpC của vi khuẩn E. tarda [51]. Khi nhân gen bằng cặp mồi Eip18 sẽ tạo ra sản phẩm PCR khoảng 440 bp. Như vậy, nếu khuếch đại được đoạn gen eip18 chứng tỏ vi khuẩn mang gen này là E. ictaluri. Từ các mẫu vi khuẩn phân lập được ở cá tra Việt Nam (E5 và E40) đã được xác định bằng phương pháp hóa sinh và sinh học phân tử cùng với đối chứng dương là vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202 và đối chứng âm là vi khuẩn E. tarda ATCC 14569 kết hợp với xác định sự có mặt của gen đặc trưng một lần nữa khẳng định các mẫu vi khuẩn được lựa chọn nghiên cứu là E. ictaluri.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, những vi khuẩn cùng thuộc một loài có thể gây bệnh trên các đối tượng khác nhau, ở các vùng địa lý khác nhau có thể có những khác
1 2 3 M 4 1000 1000 500 100 bp 440
81
biệt về mặt di truyền. Dựa vào trình tự gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri để thiết kế bộ mồi khuếch đại gen đặc trưng này bằng phương pháp LAMP. Trình tự gen eip18 của mẫu vi khuẩn phân lập tại Việt Nam được so sánh với trình tự gen eip18 của vi khuẩn
E. ictaluri ATCC 33202 và gen evpC của vi khuẩn E. tarda để từ đó có thể thiết kế mồi đặc trưng nhân gen eip18 trên đối tượng vi khuẩn gây bệnh cho cá tra Việt Nam.