M E5/3 E5/4 E40/3 Ei/10 ĐC
6: E.ictaluri ATTC 3
3.5.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng
Theo khuyến cáo của nhà cung cấp, hoạt tính tối ưu của Bst ADN polymerase đạt được ở nhiệt độ 65oC. Song, theo nghiên cứu của một số tác giả trên thế giới về nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính tự tách chuỗi và tổng hợp ADN của enzym Bst có thể xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn [41, 56, 81, 83, 118]. Do đó, để xác độ nhiệt độ tối ưu cho phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18 bằng enzym này thì các phản ứng được tiến hành ở các giá trị nhiệt độ khác nhau từ 47 đến 71oC. Kết quả ở Hình 3.26A cho thấy nhiệt độ thích hợp để phản ứng xảy ra nằm trong khoảng từ 55oC đến 69oC và nhiệt độ cao nhất mà phản ứng vẫn xảy ra là 69oC. Để đảm bảo mức độ ổn định của phản ứng và phù hợp với hoạt động tối ưu của enzym Bst polymerase, giá trị nhiệt độ 65oC được chọn để thực hiện phản ứng. Thêm vào đó, nhiệt độ Tm trung bình của 4 mồi là 63,5oC là hoàn toàn phù hợp để phản ứng diễn ra đồng nhất. Giới hạn nhiệt độ của phản ứng khá rộng từ 55 đến 69oC là rất phù hợp để ứng dụng ngoài thực tế, khi không có các thiết bị gia nhiệt có độ ổn định nhiệt độ cao mà chỉ cần dùng thiết bị ổn nhiệt và có thể theo dõi nhiệt độ bằng nhiệt kế một cách rất đơn giản và thuận tiện.
M 1 2 3 bp bp
500
98
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng. M: marker 100 bp; OD400: giá trị hấp thụ quang của
Mg2P2O7 ở bước sóng 400 nm; ToC: Nhiệt độ phản ứng khuếch đại ADN bằng phương pháp LAMP.