M E5/3 E5/4 E40/3 Ei/10 ĐC
3.5.2.7.Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị Calcein
6: E.ictaluri ATTC 3
3.5.2.7.Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị Calcein
Để xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri, phản ứng được tiến hành với nồng độ ADN khuôn giảm đi 10 lần cho mỗi thí nghiệm. Nồng độ ADN genom ban đầu được xác định thông qua độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm là 94 ng/l. Các thí nghiệm được tiến hành với ADN khuôn ban đầu là 94 ng/l giảm dần nồng độ theo cấp số 10 từ 94 ng đến 94 at (Bảng 3.7).
Bảng 3.7. So sánh giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP và PCR
Phương pháp Hàm lượng ADN 94ng 9,4ng 0,94ng 94pg 9,4pg 0,94pg 94fg 9,4fg 0,94fg 94at PCR + + + + ± ± - - LAMP + + + + + + + + - -
+: quan sát được ±: hơi rõ -: không quan sát được
Kết quả thí nghiệm cho thấy phản ứng LAMP phát hiện ADN và khuếch đại được ADN ở giới hạn nồng độ thấp nhất là 9,4 fg tương ứng với đường chạy số 8. Tại giá trị này, lượng ADN được tổng hợp vẫn không thay đổi thể hiện ở các băng điện di rất rõ ràng. Kết quả quan sát trên gel agarose 2% và sự đổi màu của Calcein trong ống phản ứng là phù hợp với nhau.
106
Hình 3.35. Giới hạn phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP. M1- 100bp ADN marker, M2 – 1kb ADN
marker
1- 94 ng/l 2- 9,4 ng/l 3- 0,94ng/l 4- 94 pg/l 5-9,4 pg/l 6- 0,94 pg/l 7-94 fg/l 8- 9,4 fg/l 9- 0,94 fg/l 10-94 at/l 6- 0,94 pg/l 7-94 fg/l 8- 9,4 fg/l 9- 0,94 fg/l 10-94 at/l
Từ nhiều công bố của các tác giả khác nhau cùng sử dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện gen đích cho thấy, đây là phương pháp có giới hạn phát hiện ở mức femtogram ADN đích. Kono khi so sánh giới hạn phát hiện virut gây bệnh đốm trắng ở tôm thì thấy bằng phương pháp LAMP có thể phát hiện được virut ở giới hạn nồng độ 1fg/l, còn bằng phương pháp nested-PCR là 10 fg [61]. Cũng dùng phương pháp LAMP để phát hiện nấm Fusarium nhưng Nessie công bố chỉ phát hiện được gen đích
gaoA - gen mã hóa galactose oxidase ở nồng độ 2 pg [75], thấp hơn 100 lần so với công bố của chúng tôi.
Cũng với nồng độ ADN khuôn như trên và tiến hành so sánh độ nhạy phản ứng LAMP và PCR cùng khuếch đại gen eip18 cho thấy, giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP cao hơn rất nhiều so với phương pháp PCR. Giới hạn phát hiện gen eip18
bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi Eip18 có thể phát hiện được ở mức độ pha loãng 10-6 tương ứng với nồng độ ADN là 940 fg nhưng vạch điện di tương đối mờ.
107
Điện di đồ cho thấy ở giới hạn pha loãng ADN mà PCR có thể xác định được tương ứng nồng độ ADN là 94 pg. Trong khi đó, nếu sử dụng phương pháp LAMP có thể phát hiện được ở độ pha loãng rất cao tương ứng với 9,4 fg cao gấp 100 lần so với phương pháp PCR và quan sát được bằng mắt thường sự thay đổi chỉ thị kim loại cũng như điện di đều rất rõ ràng (Hình 3.35).
Theo quy đổi của Bilodeau và cs (2003) thì cứ 74 fg ADN tương ứng với 20 cfu/ ml [27]. Do đó, trong nghiên cứu này kỹ thuật LAMP khuếch đại gen eip18 từ vi khuẩn
E. ictaluri phân lập ở Việt Nam có thể phát hiện được là 9,4 fg tương ứng với gần 3 cfu/ml.
Số lượng bản copy của gen eip18 trong 9,4 fg mẫu ADN ban đầu được tính như sau:
Vì gen được tạo bởi các cặp bazơ nitơ với khối lượng trung bình là 650 Dalton. Tương ứng với 1 mol của 1 cặp bazơ nitơ có khối lượng 650 g. Do đó trọng lượng phân tử của cả bất kỳ sợi đôi ADN nào cũng được tính bằng: chiều dài gen (bp) x 650.
Số mol của khuôn có trong 1 gram là nghịch đảo của trọng lượng phân tử. Sử dụng hằng số Avogardro: 6,022 x 1023 phân tử/mol có thể quy ra số lượng phân tử trong 1 g mẫu theo công thức: phân tử/gram = mol/g *phân tử/mol.
Cuối cùng, số lượng các phân tử hay số lượng bản sao của mẫu trong mẫu có thể được ước tính bằng cách nhân với 109 để chuyển đổi đơn vị tính ra nanogram và sau đó nhân với hàm lượng mẫu (ng).
Số lượng bản sao được tính theo công thức:
Kỹ thuật LAMP được dùng để phát hiện đoạn gen eip18 có chiều dài 439 bp ở giới hạn 9,4 fg (94 x 10-7 ng) tương ứng với 1,98 x 104 bản copy (áp dụng công thức 1).
Số lượng bản sao của 1 gen =
Hàm lượng ADN (ng) x 6,022 x 1023 Chiều dài của gen (nu) x 109 x 650
108