M E5/3 E5/4 E40/3 Ei/10 ĐC
6: E.ictaluri ATTC 3
3.5.2.8. đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng phương pháp LAMP
Gen eip18 là gen đặc trưng của vi khuẩn E. ictaluri. Để kiểm tra mức độ đặc hiệu của bộ mồi đã được thiết kế, ADN genom của E. ictaluri và một số ADN genom tách chiết từ các loài vi khuẩn gần gũi khác điển hình là E. tarda và một số vi khuẩn kiểm định như Vibrio sp., P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, S. enteretidis, S. aureus, E. coli, P. mirabilis, A. hydrophila, Enterococcus sp. được dùng làm đối chứng âm. Sự khuếch đại đặc hiệu gen eip18 ở điều kiện tối ưu được xác định bằng điện di trên gel agarose 2%.
Hình 3.36. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng phản ứng LAMP. M1: 100 bp ADN
Marker ; M2 1kb ADN marker; 1: E. ictaluri - E 5; 2: E. ictaluri E7; 3: E. ictaluri E40; 4,11: E. ictaluri
ATCC 33202;
5: A. Hydrophila; 6: E. tarda ATCC 14569; 7: Vibrio sp.; 8: P. aeruginosa; 9: S. Typhimurium; 10: S. Enteritidis; 12: S. aureus; 13: E. coli; 14: P. mirabilis; 15: Enterococcus sp.; 16- đối chứng âm 10: S. Enteritidis; 12: S. aureus; 13: E. coli; 14: P. mirabilis; 15: Enterococcus sp.; 16- đối chứng âm
109
Kết quả trên Hình 3.36 chỉ ra rằng chỉ có các thí nghiệm mà ADN khuôn là ADN genom của các vi khuẩn E. ictaluri mới xuất hiện sản phẩm phản ứng là các băng ADN giống như ADN ladder trên điện di đồ (đường chạy 1-4 và 12). Còn ở các đường chạy khác tương ứng với sản phẩm LAMP khuếch đại gen eip18 từ các ADN khuôn là ADN genom tách chiết từ các vi khuẩn không phải là E. ictaluri thì không thấy xuất hiện sản phẩm phản ứng. Kết quả này tương tự với kết quả PCR bằng cặp mồi Eip18. Điều này chứng tỏ rằng bộ mồi mà chúng tôi thiết kế cho phản ứng LAMP rất đặc hiệu để phát hiện vi khuẩn E. ictaluri.
110
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập và xác định được một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri từ các mẫu cá tra Việt Nam có biểu hiện bệnh gan thận mủ. Các mẫu phân lập kí hiệu là E5, E7, E40 dùng trong nghiên cứu này đều được xác định là vi khuẩn E. ictaluri dựa vào phân tích trình tự rADN 16S với độ tương đồng 99,9% với vi khuẩn E. ictaluri và 99,6% với vi khuẩn E. tarda. 2. Đã chứng minh được vi khuẩn E. ictaluri là một trong những tác nhân chính gây
bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus bằng định đề Koch. Các mẫu vi khuẩn E5, E7, E40 đều có khả năng gây bệnh khi cảm nhiễm trên cá tra giống 15-30 gram với các biểu hiện triệu chứng của bệnh gan thận mủ tương tự biểu hiện của bệnh gan thận mủ ngoài tự nhiên.
3. Đã thiết kế được cặp mồi đặc hiệu nhân gen eip18 đặc trưng của vi khuẩn E. ictaluri, đã tách dòng và xác định trình tự của gen eip18 sử dụng như một chỉ thị phân tử để phân loại E. ictaluri và E. tarda: Gen eip18 của các mẫu vi khuẩn phân lập tại Việt Nam tương đồng 99 % với gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri
được công bố trên NCBI với số đăng ký NC_012779.1 và khác biệt khá lớn (tương đồng 87%) với trình tự gen evpC của vi khuẩn E. tarda với số đăng ký trên NCBI là NC_013508.1).
4. Dựa trên trình tự gen eip18 đặc trưng của vi khuẩn E. ictaluri, đã thiết kế được bộ mồi đặc hiệu phát hiện vi khuẩn E. ictaluri phân lập tại Việt Nam bằng kỹ thuật LAMP với thời gian phản ứng tối thiểu là 35 phút ở nhiệt độ từ 55 đến 69oC, nồng độ dNTPs 0,5 mM, Betain 0,1 M, tỷ lệ về nồng độ mồi ngoài bằng ½ đến 1/8 mồi trong, với nồng độ Mg2+ ban đầu 4 mM cùng với sự có mặt của Calcein thì kết quả phản ứng có thể đọc bằng mắt thường dựa vào sự thay đổi màu của dung dịch phản ứng từ cam sang xanh. Bộ mồi LAMP khuếch đại gen
111
fg tương ứng với 3 cfu/ml (1,98 x 104 bản copy), cao gấp 100 lần so với phương pháp PCR.
112
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu để sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm phát hiện vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri bằng kỹ thuật LAMP sử dụng chỉ thị phân tử là gen eip18
và chỉ thị kim loại phát huỳnh quang là Calcein.
2. Hoàn thiện quy trình sử dụng LAMP kit và thử nghiệm với số mẫu lớn hơn ở quy mô phòng thí nghiệm và ngoài thực địa.
113