B. subtilisE
3.1.5. Hoạt tính chondroitinase
Chondroitin sunfat là một heteropolysaccarit được cấu tạo chủ yếu bởi các disaccarit lặp đi lặp lại, trong đó có một đường là N-acetyl-galactosamine-D và các đường khác là D-glucuronic. Chúng là thành phần quan trọng trong cấu trúc của sụn [18]. Đối với vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh cho cá tra, một trong hai tác nhân gây độc đã được xác định và kiểm chứng là enzym chondroitinase. Nhờ có enzym này nên vi khuẩn có thể phân giải chondroitin có trong thành phần của sụn. Phần lớn cá bị bệnh gan thận mủ thường biểu hiện ở hai dạng: dạng viêm não mãn tính và dạng nhiễm trùng huyết cấp tính [52]. Ở thể viêm não mãn tính, vi khuẩn xâm nhiễm vào cá qua hệ thống túi khứu giác và đi dọc theo dây thần kinh khứu giác đến não và gây viêm não. Ở giai đoạn cuối của bệnh, cá xuất hiện khối u trên đầu ở giữa hai hố mắt và sau đó tạo nên hố đầu [82, 95].
Áp dụng theo phương pháp của Smith và cs đề xuất năm 1968 khi nghiên cứu sàng lọc các vi khuẩn có khả năng sinh hyaluronidase và chondroitin sulfatase bằng phương pháp cấy vi khuẩn trên đĩa thạch có chứa cơ chất là chondroitin sulfate A [96] thì kết quả thu được cho thấy tất cả các mẫu vi khuẩn E. ictaluri và E. tarda được nuôi cấy trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất đều mọc rất yếu. Sau 24 giờ nuôi cấy chỉ xuất hiện một vệt rất mờ, sát với mặt thạch. Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn E. tarda ATCC 14569 mọc tốt hơn, các tế bào đã tạo thành khuẩn lạc lớn, lồi trên mặt thạch trong khi vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202 và các vi khuẩn nghiên cứu vẫn mọc rất yếu. Hiện vòng thủy phân bằng axit axetic 2N chỉ thấy một vùng trong suốt dưới vết tế bào nuôi cấy. Nguyên nhân có thể do vi khuẩn mọc rất chậm và yếu nên việc tiết enzym bị hạn chế. Vì thế, chúng tôi chuyển sang kiểm tra hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cũng áp dụng phương pháp của Smith và cs nhưng có cải tiến cho
74
phù hợp. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dịch BHIB có bổ sung cơ chất cảm ứng là chondroitin sulfate A nồng độ 0,4 g/ml ở 30oC từ 18-24 giờ, ly tâm thu dịch thô. Hoạt tính chondroitinase được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng phân giải xung quanh lỗ thạch được hiện màu bằng dung dịch CH3COONa 2N. Kết quả ở hình 3.8 cho thấy các mẫu vi khuẩn kiểm tra đều có hoạt tính chondroitinase tương tự vi khuẩn chuẩn, kích thước vòng phân giải lớn và rõ ràng.
Bảng 3.2. Hoạt tính phân giải chondroitin của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
Hình 3.8. Hoạt tính chondroitinase của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu