CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.8. Biến nạp ADN plasmid
Nguyên tắc: sử dụng sự thay đổi nhiệt độ đột ngột (sốc nhiệt) để lỗ màng tế bào mở ra, nhờ đó mà ADN có thể dễ dàng xâm nhập qua màng tế bào vào bên trong. Khi ngừng sốc nhiệt và giữ ở điều kiện lạnh, màng tế bào hồi phục lại và giữ ADN lạ trong tế bào. Tế bào chứa ADN tái tổ hợp có khả năng biểu hiện gen kháng kháng sinh nên được chọn lọc trên môi trường chứa chất kháng sinh.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Chủng vi khuẩn được cấy ria trên môi trường LBA và ủ ở 37oC qua đêm. Cấy một khuẩn lạc đơn trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút (v/p) qua đêm. Chuyển 0,5 ml dịch nuôi cấy sang 50 ml LB, lắc tiếp 200 v/p đến khi OD600 đạt 0,4-0,6 thì chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá. Đặt mẫu trên đá 1 giờ, ly tâm 4000 v/p ở 4oC, 10 phút thu tế bào. Hòa tế bào trong 50 ml 100 mM CaCl2, giữ trên đá 15 phút, ly tâm 3500 v/p, 4oC, 10 phút thu tế bào. Hòa cặn tế bào trong 25 ml 100 mM CaCl2, giữ trên đá 60 phút, ly tâm 4000 v/p, 4oC, 10 phút thu cặn tế bào. Hòa cặn tế bào trong 0,5 ml CaCl2. Chia vào mỗi ống 0,1 ml dịch tế bào, bổ sung 50 l glycerol 60%, làm đông lạnh nhanh bằng nito lỏng và giữ ở -80oC. Cấy trải mẫu trên đĩa chứa môi trường LB và LBA để kiểm tra.
59
Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt: Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -80oC và được làm tan trên đá trong khoảng 30 phút để tránh hiện tượng sốc nhiệt. Lấy 3 l sản phẩm plasmid tái tổ hợp bổ sung vào mỗi ống chứa 100 l tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng để ADN phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó, để mẫu trên đá trong khoảng 30 phút. Tạo sốc nhiệt bằng cách đưa mẫu vào bể ổn nhiệt với nhiệt độ là 42oC và ủ mẫu trong 1 phút 30 giây. Lấy mẫu ra rồi đặt trên đá trong 2 phút. Bổ sung vào khoảng 500 - 600 l LB lỏng, lắc ở 37oC trong 60 phút. Lấy 100 l dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Ampicillin 100g/ml, ủ mẫu ở tủ 37oC qua đêm.