M: Marker protein; 1-3: 3 mẫu huyết thanh NHL;
4: Mẫu huyết thanh bình thƣờng
95
CD20 trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ tế bào lympho mạn tính của Manshouri và cộng sự [88].
3.6.2.Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA 3.6.2.1. Lựa chọn độ pha loãng huyết thanh 3.6.2.1. Lựa chọn độ pha loãng huyết thanh
Trong huyết thanh có nhiều thành phần vô cơ, hữu cơ nhƣ các ion kali, natri, can xi, phospho… hay các loại protein, các thành phần này có thể gây nhiễu khả năng liên kết đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên đích trong huyết thanh.
Vì vậy, cẩn phải phải xác định độ pha loãng của huyết thanh để kháng nguyên và kháng thể liên kết đặc hiệu tốt nhất.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định độ pha loãng của huyết thanh bệnh nhân NHL mà tại nồng độ đó phản ứng giữa kháng nguyên CD20 với kháng thể scFv-CH2 và với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại đạt giá trị OD (450-650 nm) cao nhất bằng phản ứng ELISA trực tiếp. Huyết thanh của 1 bệnh nhân NHL (đã xét nghiệm hóa mô miễn dịch CD20 dƣơng tính) và 1 ngƣời bình thƣờng đƣợc pha loãng ở các nồng độ (1, 1/10, 1/100, 1/1000) sau đó cho liên kết với scFv-CH2 và với kháng thể thƣơng mại (KTC).
Ở bệnh nhân NHL, hoạt tính liên kết giữa kháng nguyên CD20 với scFv-CH2 và với KTC cao nhất khi pha loãng huyết thanh 100 lần (0,158; 0,161), tiếp đến là pha loãng 1000 lần (0,157; 0,156) và hoạt tính thấp nhất là khi huyết thanh không pha loãng (0,086; 0,081) (Hình 3.43). Ở ngƣời bình thƣờng, huyết thanh pha loãng
Hình 3.42. Kết quả Western blot với huyết thanh bệnh nhân NHL
A: kháng thể scFv-CH2; B: kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (abcam) 1: Mẫu máu đối chứng âm; 2-4: Mẫu máu liên kết với kháng thể 1: Mẫu máu đối chứng âm; 2-4: Mẫu máu liên kết với kháng thể
96
ở các nồng độ thì hoạt tính liên kết với kháng thể đều xấp xỉ với đối chứng âm là đệm PBS và thấp hơn hẳn so với mẫu bệnh NHL.
Nhƣ vậy, huyết thanh bệnh nhân đƣợc pha loãng 100 lần cho khả năng liên kết với kháng thể cao nhất.
3.6.2.2. Thử nghiệm scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA bằng ELISA
Hiện nay, có nhiều kháng thể đơn dòng đặc hiệu CD20 đã đƣợc sản xuất sử dụng cho nghiên cứu, do đó rất thuận lợi để xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với CD20 và so sánh với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại.
Giles và cộng sự đã xác định đƣợc mức độ biểu hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân NHL trƣớc khi điều trị và sau khi điều trị bằng kháng thể rituximab thông qua phản ứng ELISA [57]. Tác giả này còn xác định đƣợc điểm ngƣỡng CD20 có giá trị trong chẩn đoán và điều trị.
Tuy nhiên, ở nghiên cứu này chúng tôi mới thử nghiệm kháng thể scFv-CH2 tạo ra để phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân NHL và bƣớc đầu so sánh khả năng liên kết của scFv-CH2 với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (abcam), tiến hành 2 phản ứng ELISA trực tiếp song song:
1) CD20 - scFv-CH2 – Kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidine
2) CD20 – KTC (kháng thể kháng CD20 thƣơng mại) – KT cộng hợp kháng KTC
Phản ứng ELISA với các mẫu huyết thanh pha loãng 100 lần: 30 mẫu huyết thanh NHL (đã đƣợc chẩn đoán và xét nghiệm hóa mô miễn dịch 24 mẫu CD20 dƣơng tính, 6 mẫu CD20 âm tính), 1 mẫu ngƣời bình thƣờng và 1 mẫu đối chứng âm (đệm PBS). Kết quả ELISA đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và Hình 3.44.
Hình 3.43. Biểu đồ kết quả ELISA xác định độ pha loãng của huyết thanh bệnh nhân NHL
MB: mẫu huyết thanh ngƣời bệnh; MT: mẫu huyết thanh ngƣời bình thƣờng
KTC: Kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (abcam), scFv-CH2: kháng thể scFv-CH2
97
Bảng 3.3. Kết quả ELISA xác định hoạt tính của scFv-CH2 và so sánh với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (abcam)
STT ELISA ELISA XNHMM D (CD20) STT ELISA XNHMM D (CD20) scFv- CH2 KTC scFv- CH2 KTC NHL1 0,156 0,142 + NHL17 0,169 0,173 ++ NHL2 0,158 0,162 + NHL18 0,172 0,165 ++ NHL3 0,183 0,173 +++ NHL19 0,139 0,149 +++ NHL4 0,197 0,188 ++ NHL20 0,155 0,116 + NHL5 0,174 0,173 ++ NHL21 0,129 0,161 + NHL6 0,136 0,127 + NHL22 0,127 0,153 + NHL7 0,151 0,153 + NHL23 0,187 0,166 +++ NHL8 0,168 0,172 ++ NHL24 0,157 0,163 + NHL9 0,119 0,102 ++ NHL25 0,069 0,061 - NHL10 0,133 0,124 + NHL26 0,071 0,077 - NHL11 0,152 0,162 + NHL27 0,058 0,065 - NHL12 0,118 0,122 ++ NHL28 0,068 0,077 - NHL13 0,18 0,175 +++ NHL29 0,072 0,066 - NHL14 0,162 0,172 + NHL30 0,067 0,065 - NHL15 0,148 0,151 + HTT 0,061 0,058 NHL16 0,147 0,131 + ĐC (-) 0,056 0,055
XNHMMD: Xét nghiệm hóa mô miễn dịch; NHL: Bệnh nhân ung thư lympho không
Hodgkin; HHT: Huyết thanh thường; ĐC: Đối chứng.
Giá trị OD của các mẫu huyết thanh bệnh nhân NHL CD20 dƣơng tính cao hơn hẳn huyết thanh bệnh nhân NHL CD20 âm tính, huyết thanh ngƣời bình thƣờng và đối chứng (Hình 3.44) (Bảng 3.3). Ở các mẫu NHL CD20 dƣơng tính giá trị OD cũng khác nhau, điều này có thể do nồng độ CD20 trong các mẫu huyết thanh NHL khác nhau (CD20: +++; ++; +) nên giá trị OD cũng khác nhau. Nhƣ vậy, scFv- CH2tạo ra có khả năng phát hiện đƣợc CD20 trong huyết thanh bệnh nhân NHL.
98
Ngoài ra, khả năng liên kết của 2 loại kháng thể (scFv-CH2 và kháng thể kháng CD20 thƣơng mại) với các mẫu huyết thanh bệnh nhân NHL và ngƣời bình thƣờng có sự khác biệt nhau, tuy nhiên sự sai khác này không nhiều (Hình 3.44). Để khẳng định sự sai khác giữa hai loại kháng thể này có ý nghĩa hay không? Chúng tôi kiểm tra với công cụ Excell dùng hàm Ftest và Ttest.
Các giá trị OD đƣợc nhập vào để kiểm chứng sự sai khác bằng việc sử dụng hàm Ftestvới số mẫu n 30. Sau khi thực hiện thuật toán thu đƣợc giá trị p(Ftest) = 0,9497 > 0,05. Do đó, thuật toán Ttest lại đƣợc thực hiện nhằm kiểm tra 2 chiều và thu đƣợc giá trị p(Ttest) = 0,9072 > 0,05. Nhƣ vậy, sự sai khác giữa giá trị OD thu đƣợc của 2 loại kháng thể này là không có ý nghĩa. Hay kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với CD20 trong huyết thanh tƣơng đƣơng với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (abcam).
Giles và cộng sự nghiên cứu mức độ biểu hiện của CD20 dạng hòa tan trong huyết thanh của 65 bệnh nhân NHL trƣớc khi điều trị và sau khi điều trị bằng mAb (Rituximab) [57]. Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ biểu hiện CD20 ở bệnh nhân NHL cao hơn hẳn so với bệnh nhân bình thƣờng cũng tƣơng tự nhƣ nghiên
Giá trị OD
Hình 3.44. Biểu đồ kết quả ELISA phát hiện CD20 trong huyết thanh và so sánh hoạt tính liên kết của scFv-CH2 với kháng thể thƣơng mại ở bệnh nhân NHL