M: marker protein màu; 1: kháng nguyên CD20; 2: Đối chứng âm
3.4.2.Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)/antiCD
Sản phẩm PCR ở trên đƣợc tinh sạch từ gel agarose. Do có vị trí cắt của
EcoRI và XhoI ở 2 đầu của gen nên sau khi xử lý sản phẩm PCR trực tiếp với hai enzyme trên thu đƣợc đoạn gen antiCD20 với các đầu dính cần thiết cho việc gắn vào vector biểu hiện. Vector pET22b(+) cũng đƣợc cắt mở vòng bằng hai enzyme
Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR gen antiCD20
70
giới hạn trên. Đoạn gen antiCD20 đƣợc gắn vào vector pET22b(+) nhờ T4-ligase. Sản phẩm lai đƣợc biến nạp vào chủng DH5 và chọn dòng bằng PCR với cặp mồi T7F/R (Hình 3.15).
Gắn đoạn gen antiCD20 vào vector biểu hiện đƣợc kiểm tra bằng PCR sử dụng trực tiếp 4 khuẩn lạc chọn ngẫu nhiên từ đĩa nuôi cấy với cặp mồi T7F/R của vector pET-22b(+). Ở tất cả các đƣờng chạy, sản phẩm PCR xuất hiện một băng đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 840 bp hoàn toàn phù hợp với tính toán về tổng kích thƣớc của đoạn gen antiCD20 (727 bp) và một phần của vector pET22b(+) (hơn 100 bp) khi PCR mồi T7F/R.
Trình tự gen antiCD20 trong plasmid tái tổ hợp pET22b(+)/antiCD20 (Phụ lục 2) mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu CD20 có mang đầy đủ mã mở đầu (ATG), mã kết thúc (TGA), trình tự liên kết VH-VL (linker: SSGGGGSGGGGSGS) và các thành phần khác của gen. Nhƣ vậy, gen antiCD20 đã gắn vào pET22b(+) đúng chiều và đúng khung đọc.
Biểu hiện gen mã hóa scFv trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)
Sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen antiCD20 vào tế bào
E. coli BL21 bằng sốc nhiệt. Cấy trải sản phẩm biến nạp trên môi trƣờng LB chọn
Hình 3.15. Ảnh điện di pET22b(+) và gen antiCD20