80
Hàm lƣợng scFv đông khô sau 1 ngày kiểm tra còn nhiều ở các nhiệt độ bảo quản 4oC, -20oC, -80oC (tƣơng ứng 1,5; 1,52; 1,53 mg/ml) (Hình 3.27). Tuy nhiên, hàm lƣợng kháng thể giảm đi nhanh chóng sau 15, 30 ngày và đến 45 ngày gần nhƣ không còn kháng thể ở các nhiệt độ 4oC, -20oC, -80oC (tƣơng ứng 0; 0; 0,02 mg/ml). Hàm lƣợng scFv giảm đi này có thể trong quá trình bảo quản scFv bị phân hủy bởi một số protease. Qua thí nghiệm này cho thấy, scFv không ổn định ở các điều kiện bảo quản trên.
Mặc dù, scFv hạn chế tối đa hiện tƣợng HAMA và kích thƣớc nhỏ của scFv thuận lợi khi thâm nhập vào các mô đích [74], [61]. Tuy nhiên, scFv lại có hạn chế nhƣ khả năng liên kết với kháng nguyên và tính nhạy yếu trong các phản ứng hóa miễn dịch (ELISA) [105]. scFv có gắn thêm phần cố định kháng thể Fc (CH1, CH2, CH3) đã khắc phục đƣợc hạn chế này, tăng độ bền của kháng thể và Fc có vai trò quan trọng trong việc giết chết tế bào trực tiếp thông qua cơ chế CDC, hoạt hóa tế bào miễn dịch, giết chết tế bào thông qua cơ chế ADCC và gây chết tế bào theo chƣơng trình [110].
Vì vậy, để tạo ra lƣợng lớn kháng thể kháng CD20 có hoạt tính và ổn định hơn scFv tạo ra trƣớc đó, thì gen mã hóa cho kháng thể kháng CD20 cần đƣợc thiết kế mới (antiCD20Fa) có thêm đoạn CH2 (scFv- CH2) và đƣợc gắn vào 3 vector biểu hiện (pET28a, pET30GB1; MBP).
Hình 3.27. Biểu đồ xác định hàm lƣợng kháng thể scFv bảo quản ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau
81
3.5. TẠO KHÁNG THỂ scFv-CH2 KHÁNG CD20
Mỗi phân tử kháng thể ở dạng đơn phân đƣợc cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide bao gồm 2 chuỗi nhẹ (L - light) và 2 chuỗi nặng (H - heavy) giống nhau. Trên mỗi chuỗi nhẹ và chuỗi nặng đều có các vùng biến đổi (V – variable) và vùng hằng định (C – constant). Các chuỗi nặng chứa 3 hoặc 4 vùng hằng định, tùy theo lớp kháng thể CH1, CH2, CH3 và CH4. Vùng hằng định của chuỗi nặng không có vai trò nhận diện kháng nguyên, mà có các vị trí đóng vai trò là thụ thể để gắn với bổ thể. Thông qua các vị trí này mà kháng thể phát huy các hoạt tính sinh học nên vùng hằng định đƣợc coi là vùng quyết định các hoạt tính sinh học của kháng thể [3], [4].
Vì vậy, để tăng độ bền và hoạt tính liên kết của kháng thể với kháng nguyên CD20, gen antiCD20Fa đƣợc thiết kế có chứa các trình tự mã hóa cho đoạn CH2 thuộc vùng hằng định và vùng biến đổi scFv của kháng thể kháng CD20.
3.5.1. Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa scFv-CH2
Hai băng (CH2, scFv) có kích thƣớc ~ 300 bp và ~ 700 bp tƣơng ứng kích thƣớc gen mã hóa cho đoạn CH2 và scFv (Hình 3.28.A) và băng có kích thƣớc ~ 1000 bp bằng tổng kích thƣớc của gen mã hóa CH2 và scFv (Hình 3.28.B), đây chính là kích thƣớc của đoạn gen mã hóa cho kháng thể scFv-CH2 (gen
antiCD20Fa). Gen antiCD20Fa đƣợc giải trình tự, kết quả cho thấy đầu gen có mang trình tự enzyme BamHI (GGATCC) và cuối gen mang trình tự enzyme XhoI (CTCGAG), đoạn liên kết VH-VL (linker: SSGGGGSGGGGSGS), VH-VL nối với CH2 tại vị trí enzyme SmaI (CCCGGG) và các phần khác nhƣ thiết kế.
Hình 3.28.A: Ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa CH2 và kháng thể scFv;
B: Nối gen mã hóa scFv và CH2