82
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tạo đƣợc gen mã hóa cho kháng thể chứa phần cố định (CH2) có nguồn gốc từ ngƣời. Đoạn gen này mang BamHI và XhoI ở 2 đầu nên thuận lợi cho việc thiết kế vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2.
3.5.2. Sàng lọc hệ vector biểu hiện scFv-CH2
Ba vector (pET28a, pET30GB1; MBP) biểu hiện đƣợc lựa chọn để gắn gen
antiCD20Fa có ƣu thế hơn so với vector pET22b(+) vì pET22b(+) có 1 đoạn trình tự gen mã hóa cho 6 histidine nằm ở 1 đầu của gen đích khi gắn vào. Trong khi đó, 3 vector này đã có sẵn 2 đoạn trình tự gen mã hóa cho 6 histidine ở hai đầu của gen đích sau khi gắn vào nên rất thuận tiện cho việc thu nhận, tinh sạch và nhận biết kháng thể scFv-CH2.
3.5.2.1. Nhân dòng các vector biểu hiện scFv-CH2
Gen antiCD20Fa (sản phẩm PCR) đƣợc tinh sạch và thôi gel theo kit của hãng QIAGEN sau đó cắt bằng BamHI và XhoI. Các vector pET28a, pET30GB1 và MBP cũng đƣợc cắt bằng BamHI và XhoI. Vector tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách đem gắn gen antiCD20Fa vào 3 vector cùng xử lí với BamHI và XhoI. Các vector này đƣợc biến nạp vào chủng DH5α nhân lên lƣợng lớn.
PCR đƣợc sử dụng để chọn dòng từ các khuẩn lạc, chọn 6 khuẩn lạc (mỗi vector tái tổ hợp lấy 2 khuẩn lạc) để PCR với các cặp mồi tƣơng ứng (pET28a: T7F/R; pET30GB1: T7F/R; MBP: Fa/CHR). Khuẩn lạc nào chứa plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa) và (pET30GB1/antiCD20Fa), sản phẩm PCR từ khuẩn lạc đó cho kích thƣớc gần 200 bp của mồi T7 cộng với kích thƣớc gen antiCD20Fa
khoảng 1000 bp là xấp xỉ 1200 bp. Khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp (MBP/antiCD20Fa), sản phẩm PCR từ khuẩn lạc đó cho kích thƣớc bằng với kích thƣớc gen antiCD20Fa là khoảng 1000 bp.
Hai khuẩn lạc chứa vector MBP (đƣờng chạy số 1, 2) có băng kích thƣớc khoảng 1000 bp, 2 khuẩn lạc chứa vector pET30GB1 (đƣờng chạy số 3, 4) và 2 khuẩn lạc chứa vector pET28a (đƣờng chạy số 5, 6) cùng có băng kích thƣớc ~ 1200 bp (Hình 3.29). Kết quả này phù hợp với tính toán lí thuyết. Nhƣ vậy, gen
83
3.5.2.2. Biểu hiện kháng thể scFv-CH2 trong hệ vector
Ba plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa, pET30GB1/antiCD20Fa và MBP/antiCD20Fa) đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli BL21, nuôi biểu hiện ở 37oC trong 4 h có bổ sung Ka (50 µg/ml) và chất cảm ứng IPTG (0,5 mM).
Các mẫu cảm ứng IPTG (đƣờng chạy số 2; 4; 6) xuất hiện một băng protein mới có kích thƣớc tƣơng ứng (pET28a: ~ 43 kDa; pET30GB1: ~ 50 kDa; MBP: ~ 85 kDa), còn ở mẫu không cảm ứng (đƣờng chạy số 1; 3; 5) không thấy xuất hiện các băng này (Hình 3.30). Các băng protein xuất hiện mới này khả năng lớn là protein tái tổ hợp đích cần biểu hiện. Nhƣ vậy các vector tái tổ hợp đều có khả năng biểu hiện kháng thể tái tổ hợp đích.
Hình 3.30. Ảnh điện di biểu hiện gen mã hóa scFv-CH2 trong 3 vector M: marker; pET28a (1: Trƣớc cảm ứng; 2: Sau cảm ứng)
pET30GB1 (3: Trƣớc cảm ứng; 4: Sau cảm ứng) MBP (5: Trƣớc cảm ứng; 6: Sau cảm ứng)
Hình 3.29. Ảnh điện di sản phẩm PCR gen antiCD20Fa gắn vào các vector biểu hiện
M: marker DNA; 1, 2: 2 khuẩn lạc chứa vector MBP; 3, 4: 2 khuẩn lạc chứa vector pET30GB1; 5, 6: 2 khuẩn lạc chứa vector pET28a pET30GB1; 5, 6: 2 khuẩn lạc chứa vector pET28a
84
3.5.2.3. Chọn vector biểu hiện scFv-CH2
Các vector đều có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp, tuy nhiên để lựa chọn đƣợc vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 có hàm lƣợng cao nhất cần phải tiến hành Western blot.
Theo nhƣ thiết kế, scFv-CH2 tái tổ hợp gắn thêm 6-histidine ở 2 đầu. Dựa vào đặc điểm này có thể xác định hoạt tính liên kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidine (Hình 3.31).
Vector pET28a (đƣờng số 1) và vector pET30GB1 (đƣờng số 2) xuất hiện băng kích thƣớc nằm trong khoảng 40-55 kDa, tuy nhiên kích thƣớc protein của đƣờng số 1 (~ 43 kDa) thấp hơn và xuất hiện đậm hơn đƣờng số 2 (~ 50 kDa), vector MBP (đƣờng số 3, 4) không xuất hiện băng kích thƣớc ~ 85 kDa theo tính toán lí thuyết (Hình 3.31).
Nhƣ vậy, kháng thể tái tổ hợp từ vector pET28a có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector MBP, pET30GB1. Mặt khác kháng thể tạo ra từ pET28a không gắn đoạn protein dung hợp nên sau khi tinh sạch protein này không phải loại bỏ phần protein dung hợp mà có thể tiến hành ngay các nghiên cứu về chẩn đoán bệnh.
Sau khi sơ bộ kiểm tra khả năng biểu hiện và xác định hoạt tính của kháng thể chúng tôi thấy vector tái tổ hợp pET28a/antiCD20Fa biểu hiện tốt và có hoạt
Hình 3.31. Hình ảnh Western blot của kháng thể scFv-CH2 ở 3 vector biểu hiện
85
tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector pET30GB1/antiCD20Fa và MBP/antiCD20Fa. Vì vậy, Vì vậy, pET28a đƣợc lựa chọn làm vector biểu hiện gen antiCD20Fa và vector tái tổ hợp pET28a/antiCD20Fa đƣợc chọn để xác định trình tự.
Trong 2 dòng chọn đƣợc (khuẩn lạc) chứa vector tái tổ hợp pET28a/antiCD20Fa, sản phẩm PCR với mồi T7 của dòng thứ 2 (đƣờng chạy số 6 – Hình 3.29) đƣợc chọn để xác định trình tự trên máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer.
Trình tự DNA và protein suy diễn kháng thể scFv-CH2 đặc hiệu CD20 (phụ lục 3) cho thấy, đoạn gen ngoại lai antiCD20Fa gắn vào vector pET28a đã có đầy đủ mã mở đầu (ATG), mã kết thúc (TGA), 2 đoạn gen mã hóa cho 6-histidine , đoạn liên kết VH-VL (linker: SSGGGGSGGGGSGS) và các phần khác nhƣ thiết kế. Nhƣ vậycó thể khẳng định gen mã hóa kháng thể scFv-CH2 đã gắn vào vector biểu hiện pET28a đúng chiều và đúng khung đọc.
3.5.3. Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv-CH2
Để thu đƣợc lƣợng lớn kháng thể scFv-CH2, chủng E. coli chứa plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa) cần đƣợc nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp nhất (nồng độ IPTG, thời gian thu mẫu sau cảm ứng IPTG, nhiệt độ, mật độ quang học).
Ảnh hƣởng của IPTG
Chủng E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET28a/antiCD20Fa đƣợc cảm ứng bởi IPTG ở các nồng độ 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1 mM. Sau 5 h cảm ứng thu mẫu và điện di protein kiểm tra kết quả (Hình 3.33). Hàm lƣợng kháng thể tái tổ hợp theo tính toán có kích thƣớc ~ 43 kDa ở các nồng độ IPTG từ 0,1 – 1 mM gần nhƣ không khác nhau (Hình 3.32). Do vậy, nồng độ IPTG là 0,3 mM đƣợc lựa chọn để tối ƣu hàm lƣợng protein.
86
Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy
Trong nghiên cứu này, chủng E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa) đƣợc nuôi cấy ở 22oC; 30oC và 37oC cùng thu mẫu sau 5 h cảm ứng và nồng độ IPTG 0,3 mM (Hình 3.33).
Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp (kháng thể scFv- CH2). Ở 30oC băng protein ~ 43 kDa xuất hiện đậm nhất (đƣờng số 1), ở 37oC băng protein này xuất hiện ít hơn (đƣờng số 3) và ở 22oC gần nhƣ không thấy xuất hiện băng protein quan tâm (đƣờng số 2) (Hình 3.33). Nhƣ vậy, nuôi cấy chủng E. coli chứa vector tái tổ hợp ở 30oC biểu hiện protein cao hơn ở 37oC và 22oC. Kết quả này cho thấy nhiệt độ cảm ứng tốt nhất của kháng thể scFv-CH2 là 30oC, khác
Hình 3.33. Ảnh điện di mức độ biểu hiện của scFv-CH2 theo nhiệt độ
M: marker; 4: Trƣớc cảm ứng IPTG; 1: 30oC; 2: 22oC; 3: 37oC
Hình 3.32. Ảnh hƣởng của IPTG đến mức độ biểu hiện của scFv-CH2