3 Độ ác tính cao
2.2.1.3. Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2
Các sản phẩm PCR (gen CD20 và scFv) sau khi kiểm tra trên gel agarose 1%, đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR2.1. Điều này có thể thực hiện đƣợc khá dễ dàng là do khả năng tổng hợp thêm một adenine ở đầu 3’ của sản phẩm dƣới tác dụng của Taq DNA polymerase mà không phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn. Trong khi đó vector pCR2.1 đƣợc thiết kế chứa một nucleotide T ở đầu 3’. Do vậy, khi có mặt topoisomerase, sản phẩm RT-PCR có thể đƣợc gắn chính xác
44
vào vector tách dòng. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector pCR2.1 đƣợc trình bày ở Bảng 2.4. Hỗn hợp phản ứng gắn đƣợc ủ ở 22oC, thời gian 1 giờ sau đó đƣợc giữ tại 4oC trong thời gian chuẩn bị để biến nạp vào tế bào khả biến. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn Thành phần Thể tích (μl) Đệm cho ligase 1 Vector pCR 2.1 2 Sản phẩm PCR 5 Toipoisomerase 1 H2O 1 Tổng thể tích 10
2.2.1.4. Biến nạp plasmid vào tế bào E. coli
Nguyên tắc
Dựa vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trƣởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen kháng kháng sinh có trong vector.
Chuẩn bị tế bào khả biến
Chủng tế bào đƣợc cất giữ ở -75oC đƣợc cấy vạch tế bào trên đĩa môi trƣờng LB đặc, ủ đĩa cấy qua đêm ở 37oC. Lấy một khuẩn lạc nuôi cấy trong 2 ml môi trƣờng LB lỏng. Cấy chuyển 2% dịch nuôi tế bào qua đêm sang 2 ml môi trƣờng LB lỏng. Nuôi lắc ở 37oC, 200 v/ph trong 90 phút đến OD600 đạt 0,5 - 0,7. Chuyển dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút. Ly tâm thu sinh khối (5000 v/ph, 4oC trong 10 phút). Loại dịch nổi, đặt ống chứa tế bào trong đá 10 phút. Hòa tan cặn tế bào trong 1 ml CaCl2 100 mM, búng nhẹ. Đặt ống tế bào trong đá 30 phút. Ly tâm 3000 v/ph trong 10 phút. Hoà lại tế bào trong 60 l CaCl2 100 mM, búng nhẹ cho tan hết tế bào. Để ống tế bào trong đá trƣớc khi sử dụng tối thiểu 1 h.
45
Biến nạp vào E. coli
Vector tái tổ hợp (10-50 ng) đƣợc trộn với tế bào trong ống tế bào khả biến, sau đó để trên đá 30 phút. Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giây. Đặt trên đá 2 phút. Bổ sung 200 l LB lỏng, nuôi lắc (200 v/ph) ở 37oC trong 1h. Cấy trải 100 l dịch nuôi lên trên môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh Amp (100 g/ml) hoặc Ka (50 g/ml), ủ đĩa ở 37oC, qua đêm.