3 Độ ác tính cao
2.2.1.10.Tinh sạch DNA và cắt, gắn DNA Tinh sạch DNA
Tinh sạch DNA
Bổ sung đệm PB với thể tích gấp 3 lần thể tích dung dịch DNA cần tinh sạch, đảo đều, chuyển sang cột tinh sạch. Ly tâm 12.000 v/p, 1 phút, loại dịch. Bổ sung 700 l đệm rửa PE, để 1 phút, ly tâm nhƣ trên, loại dịch. Ly tâm thêm một lần nữa để loại hoàn toàn đệm rửa. Dùng 30-50 l nƣớc tinh khiết để thu DNA vào ống eppendorf mới.
Phƣơng pháp cắt, gắn DNA
Cắt DNA dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu từ 4-8 bp của các enzyme cắt giới hạn để cắt các đoạn DNA ở vị trí xác định, tạo thành những
48
đoạn DNA có đầu bằng hoặc đầu dính, có kích thƣớc xác định để làm nguyên liệu và kiểm tra trong phản ứng gắn.
Gắn DNA dựa vào khả năng xúc tác hình thành các liên kết, nối hai đoạn nucleic acid với nhau của enzyme ligase để tạo thành DNA tái tổ hợp.
Trong đề tài sử dụng các enzyme cắt giới hạn và gắn: EcoRI, XhoI, NdeI và T4-DNA ligase. Enzyme thƣờng đƣợc pha trong đệm với thành phần và pH môi trƣờng thích hợp cho hoạt động của enzyme. Trong một thể tích nhất định có đầy đủ các thành phần trong đệm cho một enzyme hoạt động, các DNA cần cắt gắn cùng với số lƣợng enzyme tƣơng ứng và đƣợc ủ ở nhiệt độ thích hợp, các enzyme sẽ cắt hoặc gắn DNA cho sản phẩm mong muốn. Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn có trong Bảng 2.5. Toàn bộ hỗn hợp trên đƣợc cắt ở 37oC trong 4 h.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn
Thành phần Thể tích H2O 7,5 μl Plasmid 5 μl Đệm 1,5 μl Enzyme giới hạn 1 0,5 μl Enzyme giới hạn 2 0,5 μl Tổng thể tích 15 μl Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn DNA Thành phần Thể tích DNA 6 μl Plasmid 2,4 μl Đệm 1 μl T4-Ligase 0,6 μl Tổng thể tích 10 μl