M: marker protein màu; 1: kháng nguyên CD20; 2: Đối chứng âm
3.3.1. Tạo gen tái tổ hợp mã hóa cho scFv từ gà gây miễn dịch
Tủy xƣơng của gà sau khi gây miễn dịch với kháng nguyên CD20 đƣợc sử dụng làm nguyên liệu tách chiết RNA tổng số (Hình 3.10). Kết quả điện di cho thấy, RNA tổng số tách đƣợc có thể sử dụng để tiến hành phản ứng RT-PCR tạo cDNA và các phản ứng tiếp theo. 3.205 0.672 2.613 0.492 2.207 0.581 0.477 0.152 0.045 0.042 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 G à 1 G à 2 G à 3 G à 4 ĐC (-) HT gà P L (1/100) HT gà P L (1/1000)
Hình 3.9. Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau khi gây miễn dịch lần 4 (trƣớc khi lấy tủy xƣơng và lách)
HT: Huyết thanh; PL: Pha loãng
66
Kết quả điện di kiểm tra hiển thị trên Hình 3.11. Các băng sáng đặc trƣng cho sản phẩm RT-PCR nhân bản vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ với kích thƣớc lớn hơn 300 bp theo nhƣ tính toán lí thuyết.
Sau khi nhân bản đƣợc các đoạn gen mã hóa cho vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, tiến hành nối ghép gen để tạo thành đoạn gen mã hóa cho mảnh kháng thể scFv tƣơng ứng. Phản ứng nối đƣợc thực hiện theo sơ đồ trên Hình 3.12.
Hình 3.11 . Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR
M: Marker DNA 1kb; 1: Gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi nặng (VH); 2: Gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi nhẹ (VL)
Hình 3.10. Ảnh điện di RNA tổng số từ tủy xƣơng gà đã gây miễn dịch với kháng nguyên CD20
67
Từ sơ đồ có thể thấy cặp mồi CKJo-B và CSCVHo-FL hoặc CSCVHo-F đƣợc thiết kế có mang các trình tự bổ sung với nhau, do đó nhờ PCR có thể nối hai đoạn gen mã hóa VH và VL tạo thành đoạn gen mã hóa scFv với một peptide nối ngắn. Gen mã hóa kháng thể scFv đƣợc sử dụng làm khuôn để thực hiện PCR vòng 2. Nối ghép tạo gen mã hóa kháng thể scFv đƣợc thể hiện trên Hình 3.13.
Trên ảnh điện di cho thấy một băng sáng đậm với kích thƣớc hơn 700 bp, phù hợp với tính toán khi nối ghép 2 đoạn gen mã hóa cho VH và VL. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể khẳng định việc tạo gen mã hóa scFv đã thành công.
Hình 3.12. Sơ đồ tạo gen mã hóa scFv
Hình 3.13. Ảnh điện di gen mã hóa kháng thể scFv 2: Marker DNA 1 kb; 1: Mảnh scFv tạo đƣợc
68