3 Độ ác tính cao
2.2.2.2.Tinh sạch protein tái tổ hợp
Sử dụng phƣơng pháp tinh sạch bằng Kit ProbondTM (Invitrogen) có thể chuyển protein từ dạng không hòa tan thành dạng hòa tan, điều này hết sức quan trọng cho mục đích tạo ra các protein tái tổ hợp để phát triển các Kít chẩn đoán. Quá trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau:
Bƣớc 1: Chuẩn bị dịch tế bào trƣớc khi đƣa lên cột
Huyền dịch tế bào (100 ml) đã kiểm tra khả năng biểu hiện đƣợc li tâm, thu cặn tế bào. Hòa lại tế bào trong 8 ml đệm li giải. Làm tan cặn tế bào bằng cách lắc nhẹ trên máy vortex ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Phá màng tế bào bằng máy siêu âm labsonic trong thời gian 15-20 phút (siêu âm 20 giây, nghỉ 60 giây), huyền dịch tế bào để trên đá. Ly tâm dịch phá tế bào ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi loại cặn tế bào.
Bƣớc 2: Chuẩn bị cột
2 ml huyền dịch nickel resin đƣợc hút, đƣa lên cột tinh sạch dung tích 10 ml. Cột đƣợc rửa bằng 6 ml nƣớc khử ion. Bổ sung 6 ml đệm liên kết biến tính. Hòa lại resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phƣơng thẳng đứng để resin lắng xuống. Bổ sung 6 ml đệm liên kết biến tính. Hòa lại resin bằng cách đảo cột
51
bằng tay, sau đó để cột lại theo phƣơng thẳng đứng để resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột.
Bƣớc 3: Đƣa protein lên cột và đẩy ra khỏi cột
8 ml dịch phá tế bào đƣợc li tâm, đƣa lên cột. Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15-30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó để cột lại theo phƣơng thẳng đứng để resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột. Rửa cột bằng 4 ml đệm liên kết, lặp lại 3 lần. Rửa cột bằng 4 ml đệm rửa, lặp lại 2 lần. Rửa cột bằng 8 ml đệm không biến tính hay đệm hồi tính, lặp lại 2 lần (với phƣơng pháp biến tính). Đẩy protein tái tổ hợp ra khỏi cột bằng 8 ml đệm thu, thu 3-5 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Kiểm tra protein sau tinh sạch bằng điện di trên gel polyacrylamide.