3 Độ ác tính cao
1.3.4.Kháng thể phage-scF
Kháng thể phage-scFv là một thực khuẩn thể hình sợi mang các mảnh kháng thể ở một đầu của nó, hiện nay thực khuẩn thể đƣợc dùng nhiều nhất để biểu lộ kháng thể là M13. Kháng thể phage-scFv đƣợc tạo ra nhờ công nghệ phage display.
- Cấu trúc của thực khuẩn thể M13:
Hệ gen của phage có hình sợi, nhỏ, chứa khoảng hơn 10 gen phân bố sát nhau và một vùng không mã hóa, chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bản và đóng gói của phage. Khác với các virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi đƣợc tổng hợp và bài tiết khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ. Các phage f1, M13, fd đã đƣợc sử dụng để biểu hiện các chuỗi polypeptide. Hệ gen của các phage hình sợi có sự tƣơng đồng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chúng có thể thay thế cho nhau vì vậy mà các phage này đƣợc gọi chung là phage Fd. M13 kiểu dại có đƣờng kính khoảng 65Ao, dài 9300Ao. Trong cấu trúc virion của M13 chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp [72] bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính pVIII. Mỗi đầu của phage đƣợc bao phủ bởi hai protein vỏ phụ: một đầu gồm 5 bản sao của pVII và pIX, đầu kia chứa 5 bản sao của pIII và PVI. Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI. Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài của bộ gen: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngƣợc lại. Điều đặc biệt là bộ gen có thể gắn thêm đoạn DNA lớn, kích thƣớc bộ gen có thể lên đến gần 12.000 bp mà vẫn không phá vỡ quá trình bao gói của thể hoang dại [127].
23
- Cấu trúc của kháng thể phage-scFv:
Các gen mã hoá cho các mảnh kháng thể liên kết scFv có thể đƣợc dung hợp với hệ gen của M13 hoặc với gen mã hóa pIII kiểu dại. Tuy nhiên, việc gắn các gen kháng thể vào hệ gen của phage gặp một số bất lợi nhƣ:
Thứ nhất là hiệu quả biến nạp của hệ gen phage thấp hơn nhiều so với phagemid, do đó làm cản trở việc xây dựng các thƣ viện kháng thể phức tạp.
Thứ hai, việc nhân bản và biểu hiện kháng thể gắn với việc nhân bản và biểu hiện của hệ gen, điều này dẫn tới việc chọn lọc rất khó khăn. Khi sử dụng hệ gen phage để chèn đoạn gen kháng thể thì tất cả các bản sao của pIII đều dung hợp với các mảnh kháng thể. Điều này là một lợi thế cho việc chọn lọc kháng thể có khả năng liên kết với kháng nguyên. Kết quả, các phagemid đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc bộc lộ các kháng thể phage.
Kháng thể phage-scFv về cơ bản là giống với M13 kiểu dại, nhƣng chúng có một số đặc điểm khác biệt nhƣ:
- Về cấu trúc protein, kháng thể phage-scFv mang đầy đủ các protein cấu trúc giống nhƣ M13, riêng protein pIII đƣợc dung hợp với phân tử kháng thể (Hình 1.9) [112], nhƣ vậy một đầu của kháng thể phage-scFv sẽ đảm nhiệm chức năng liên kết với kháng nguyên.
- Về hệ gen, kháng thể phage-scFv chỉ mang trong mình một phagemid chứa gen III dung hợp với gen mã hóa cho kháng thể.
Đối với thƣ viện Griffin.1, các scFv đƣợc đƣa vào phagemid pHEN2, phagemid này chứa tín hiệu nhân bản, promoter, gen kháng kháng sinh và tín hiệu tạo hình thái phage riêng. Điều này cho phép phagemid có thể bọc gói lắp ráp thành hạt phage hoàn chỉnh [60]. Bằng cách sử dụng các phagemid, việc nhân bản và tạo ra kháng thể độc lập với hệ gen phage. Tuy nhiên, để tạo ra các kháng thể phage-scFv hoàn chỉnh phải cần tới sự có mặt của helper phage, thƣờng dùng là M13K07.
Kháng thể phage-scFv sử dụng lông giới tính F (pilus) để nhiễm vào E. coli
nhờ tƣơng tác giữa pIII với lông giới tính [112]. Hệ gen của kháng thể phage-scFv sau đó đƣợc chuyển vào tế bào chất của tế bào vi khuẩn, tại đó chúng nhân lên, dƣới
24
sự hỗ trợ của helperphage, các protein cần thiết cho quá trình đóng gói đƣợc tổng hợp, sắp xếp lại hình thành các kháng thể phage-scFv mới, sau đó giải phóng ra ngoài môi trƣờng.
Các kháng thể phage-scFv có một số ƣu điểm so với các kháng thể tạo ra bằng kỹ thuật lai tế bào (hybridoma), cụ thể là tạo kháng thể bằng kỹ thuật lai dung hợp cần thời gian và các thiết bị chuyên dụng, trong khi đó kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) thì các gen kháng thể đƣợc tách dòng trực tiếp từ các tế bào lách với các kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Việc tạo ra thƣ viện kháng thể phage- scFv từ các nguồn gen có thể loại bỏ việc gây miễn dịch động vật thí nghiệm và nuôi cấy một lƣợng lớn các tế bào dung hợp và cho phép tách kháng thể có ái lực cao kháng lại bất kỳ kháng nguyên nào. Biểu hiện trên phage có hiệu ích lớn trong
trƣờng hợp mà các kháng thể đơn dòng không thể thu nhận đƣợc bằng kỹ thuật lai dung hợp, chẳng hạn các kháng thể kháng kháng nguyên là các độc tố và các chất không gây đáp ứng miễn dịch.
Kỹ thuật kháng thể phage-scFv cũng có thể sử dụng để tách dòng và thu nhận các kháng thể đơn dòng từ các thể lai không ổn định về mặt di truyền. Các gen kháng thể phage-scFv còn là nguyên liệu để thu các kháng thể tái tổ hợp, từ đó
25
kháng thể tái tổ hợp có thể đƣợc sản xuất nhanh chóng và kinh tế, đồng thời cũng có thể sử dụng trong y học để chẩn đoán và điều trị bệnh.
Từ những ƣu và nhƣợc điểm của các loại kháng thể khác nhau, trong đề tài này chúng tôi sử dụng kĩ thuật phage-scFv để sàng lọc, thu kháng thể có khả năng liên kết với CD20 tốt nhất sau đó sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tạo ra kháng thể scFv và scFv-CH2.