3 Độ ác tính cao
2.2.3. Western blot và Dot blot
Sau khi đông khô, kiểm tra kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu CD20, tiến hành Western blot và Dot blot để kiểm tra phản ứng của kháng thể tinh chế đƣợc với kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidine.
Western blot
Western blot là kĩ thuật miễn dịch đƣợc sử dụng rộng rãi để thăm dò các protein đặc hiệu. Kĩ thuật này sử dụng điện di để tách các protein bởi chiều dài chuỗi polypeptide hay bởi cấu trúc 3-D của protein. Các protein này thƣờng đƣợc chuyển lên màng (nitrocellulose hoặc PVDF), tại đó chúng đƣợc thăm dò (phát hiện) bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu với protein đích.
52
Chạy điện di trên gel polyacrylamide với mẫu là kháng nguyên (hoặc kháng thể tái tổ hợp) đã tinh chế. thang protein chuẩn (Invitrogen). Ngâm màng PVDF trong methanol lạnh (-20oC) trƣớc 5 phút. Ngâm xốp và giấy thấm trong bloting buffer lạnh (4oC) trƣớc. Chuyển protein sang màng PVDF, sắp xếp các lớp theo thứ tự: Xốp – giấy thấm – gel – PVDF – giấy thấm – xốp. Tiếp tục chạy điện di trong đệm thấm lạnh, cƣờng độ 400 mA, 100 V trong 2 h. Rửa màng 3 lần bằng H2O, mỗi lần lắc 5-10 phút. Phủ màng bằng sữa gầy 5% trong TBS qua đêm. Rửa màng 3 lần bằng TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút. Rửa màng 3 lần bằng TBS, mỗi lần lắc 5-10 phút. Nhuộm bằng kháng thể kháng đuôi 6his, pha loãng 500 lần trong sữa gầy 5% trong TBS, nhuộm 2 h. Rửa màng 3 lần bằng TTBS, mỗi lần lắc 5-10 phút. Bổ sung chất hiện màu (Ống 1: 5 ml methanol, 15 mg chất hiện màu hòa tan. Ống 2: 25 ml TBS 1X, 15 μl H2O2). Trộn đều 2 ống, đổ vào màng PVDF, để trong tối 5 phút. Rửa màng nhiều lần bằng H2O.
Dot blot
Nhỏ trực tiếp kháng thể scFv lên màng (1-100 ng/µl), để khô ở nhiệt độ phòng. Cho màng vào đệm 5% sữa gầy/TBS/Tween), ủ 2 h ở 4oC. Rửa màng 3 lần với đệm TBS/Tween. Ủ màng với đệm PBS/Tween gồm 1/1000 kháng thể cộng hợp kháng đuôi 6 histidine trong 1 h ở nhiệt độ phòng. Rửa 3 lần (10 phút/lần) trong TBS/Tween. Nhuộm màu với horseradish peroxidase (HRP) trong 5-10 phút. Rửa màng bằng H2O hai lần.