3 Độ ác tính cao
1.4.3.Tình hình nghiên cứu mAb đặc hiệu CD20 hiện nay
Trải qua hơn 3 thập kỉ, các kháng thể đơn dòng kháng CD20 (anti-CD20 mAb) thế hệ mới đã đƣợc cải tiến hiệu quả hơn thế hệ cũ trong việc điều trị các tế bào lympho B ác tính và các bệnh tự miễn dịch [58], [82]. Đến nay có ít nhất 5 mAb kháng CD20 đã đƣợc FDA phê chuẩn và một số mAb đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng (Bảng 1).
37
Bảng 1.3. Một số mAb kháng CD20 đã đƣợc phê chuẩn và dùng trong điều trị [82], [94], [78]. STT mAb Chỉ định điều trị Công ty sản xuất Pha phát triển 1 rituximab (rituxan®)
MabThera® NHL, RA Genentech, Biogen FDA chuẩn, 1997 phê 2 Y90-ibritumomab
tiuxetan (Zevalin®)
NHL Biogen iDeC FDA phê
chuẩn, 2002 3 I131-tositumomab
Bexxar®
NHL GlaxoSmithKline FDA phê chuẩn, 2003 4 Ofatumumab Arzerra® CLL, NHL RA Genmab, GlaxoSmithKline FDA phê chuẩn, 2009 5 Obinutuzumab (GA101) CLL, NHL Genentech, Inc. FDA phê
chuẩn, 2013 6 Ocrelizumab NHL, RA Genentech, roche,
Biogen Pha 3
7 veltuzumab NHL, ITP immunomedics Pha 2
8 AMe-133v NHL Applied molecular
evolution, eli Lilly
Pha 2
9 TrU-015 RA Trubion Pharma,
wyeth
Pha 2 10 PrO131921 (version 114) CLL, NHL Genentech Pha 1/2 11 LFB-r603/eMAB-6 CLL Biotherapeutics,
LFB
Biotechnologies
Pha 1
Dựa vào các đặc tính chức năng hay đặc điểm liên kết mà các nhà khoa học chia các kháng thể đơn dòng kháng CD20 thành 3 thế hệ [22], [92].
Thế hệ I: Có 3 mAb kháng CD20 đã đƣợc FDA phê chuẩn dùng để điều trị NHL là (i) Rituxan (rituximab), mAb kháng CD20 đƣợc tạo ra bằng kỹ thuật di truyền, dung nạp vùng biến đổi chuỗi nặng và nhẹ của chuột (VH, VL của chuột) với vùng cố định (Fc) IgG1/κ của ngƣời; (ii) Bexxar, mAb IgG2a kháng CD20 tạo ra từ chuột và đƣợc đánh dấu phóng xạ trực tiếp bằng 131I và (iii) Zevalin, mAb IgG1 kháng CD20 tạo ra từ chuột và đƣợc đánh dấu phóng xạ 90Y [94], [22].
Thế hệ II: Các mAb thế hệ II thiết kế đoạn IgG1 (scFv) có nguồn gốc từ ngƣời, nhƣng với vùng Fc không thay đổi. Kháng thể đơn dòng thế hệ II gồm có Ofatumumab, Veltuzumab, Ocrelizumab [94].
38
Thế hệ III: Các kháng thể đơn dòng thế hệ III là thuốc miễn dịch có kích thƣớc phân tử nhỏ đƣợc tạo ra từ sự thay đổi các vùng kháng thể ngƣời (scFv, Fc, CH2, CH3 có nguồn gốc từ ngƣời) [24], [58], [94]. Kháng thể đơn dòng thế hệ III gồm có: TRU-0159, AME-133v, PRO131921, Obinutuzumab (GA101) và LFB- r603/eMAB-6.
Các mAb thế hệ II đƣợc thiết kế lợi ích tiềm năng hơn mAb thế hệ I là đoạn IgG1 (scFv) có nguồn gốc từ ngƣời, nhƣng với vùng Fc không thay đổi. Các mAb thế hệ III có nguồn gốc từ ngƣời và vùng Fc đƣợc thiết kế để cải tiến trong điều trị bằng cách thích nghi với các chức năng hiệu quả của chúng [94].
Sự thành công của các thế hệ mAb trong việc điều trị các tế bào B ác tính và các bệnh tự miễn dựa trên sự chứng minh hiệu quả và an toàn trong điều trị lâm sàng của chúng. MAb kháng CD20 thế hệ III đƣợc tạo ra bởi công nghệ Fc (protein hay glyco-engineering) tăng cƣờng sự tác động của Fc và thụ thể Fc gamma, vì vậy mà tăng hoạt tính ADCC. Ngoài ra, sự thay đổi vùng Fc có thể tác động đến các cơ chế gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể (CDC) và quá trình chết theo chƣơng trình do liên kết thông qua thụ thể Fc gamma [58].
Tóm lại, NHL là ung thƣ phổ biến thứ 5 trên thế giới [51], 85% ngƣời mắc bệnh này có nguồn gốc từ tế bào lympho B và CD20 xuất hiện khoảng 85-90% ở bệnh nhân NHL. Vì vậy, CD20 là phân tử đích tiềm năng trong chẩn đoán và điều trị bệnh NHL. Hiện nay trên thế giới có 5 loại mAb đặc hiệu kháng nguyên CD20 đã đƣợc FDA phê chuẩn dùng trong điều trị và nhiều biến thể của mAb đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng nhƣ veltuzumab, TRU-0159, AME-133v, PRO131921. Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào tạo ra mAb đặc hiệu CD20 và đặc biệt là tạo ra những kháng thể đơn chuỗi (scFv) và kháng thể đơn chuỗi gắn thêm phần cố định có nguồn gốc từ ngƣời (scFv-CH2). Vì vậy, chúng tôi đã nghiên cứu tạo ra những biến thể của mAb đặc hiệu CD20 (scFv và scFv-CH2) nhằm tạo ra các kháng thể có thể đƣợc sử dụng trong chẩn đoán bệnh sau này.
39
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Sinh phẩm
Chủng E. coli: TOP10, DH5α, BL21, TG1. Các loại vector pCR2.1, pHEN2, pET-21a(+), pET-22b(+), pET28a, pET30GB1, MBP (vector MBP do phòng Công nghệ tế bào Động vật - Viện Công nghệ sinh học thiết kế).
Enzyme T4 DNA ligase và các enzyme giới hạn: EcoRI, XhoI, SmaI, NdeI,
BamHI, SfiI do các hãng Invitrogen, Biolab cung cấp. Kháng nguyên CD20 thƣơng mại (Sino Biological), kháng thể kháng CD20 (abcam). Đoạn gen mã hóa CH2 do phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện công nghệ sinh học cung cấp.
Ba mẫu máu (bệnh phẩm) của bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin đã xét nghiệm hóa mô miễn dịch CD20 dƣơng tính, 30 mẫu huyết thanh bệnh nhân NHL (24 mẫu NHL có CD20 dƣơng tính và 6 mẫu NHL có CD20 âm tính) và 1 mẫu huyết thanh ngƣời bình thƣờng do Trung tâm huyết học truyền máu và Trung tâm ung bƣớu - Bệnh viện 198 cung cấp. Tiêu chuẩn chọn các mẫu NHL là các bệnh nhân đƣợc chẩn đoán NHL và chƣa sử dụng mAb kháng CD20 để điều trị.
Dòng tế bào lympho B ác tính biểu hiện CD20 (Raji) do Học viện Quân y cung cấp. Bốn con gà lơgo do Viện chăn nuôi cung cấp.
2.1.2. Mồi
Các cặp mồi đƣợc thiết kế chứa trình tự nhận biết của các enzyme giới hạn..
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng để tách dòng gen
Kí hiệu Trình tự nucleotide 5’→ 3’ Khuếch đại gen
CD20F CATATGGCGACGCCGCGTAA
NdeI
gen mã hóa kháng nguyên CD20
CD20R CTCGAGTGGAGAGCTATCGT
XhoI
AntiCD20F ATGGGCGCCTGAATTCTGTATTA TCTC EcoRI
gen antiCD20 mã hóa kháng thể scFv
40
AntiCD20R1 ATTTAGGTTCCTCGAGTGTTACTG TTG XhoI
Fa ATGGGAGCCTGGATCCGTATTAT
CTC BamHI
gen antiCD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2
Ra ATTTAGGTTCCCCGGGAGTAACA
TAG SmaI
CHR CAATAGGTGCCTCGAGTGCTTTAT
AG XhoI
T7F TAATACGACTCACTATAGGG Gen ngoại lai gắn vào các vector biểu hiện pET22b(+), pET28a
T7R GCTAGTTATTGCTCAGCGG
Các cặp mồi tạo thƣ viện kháng thể scFv từ gà gây miễn dịch dựa theo công bố của Jennifer và cộng sự [70].
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng để tách dòng gen mã hóa scFv từ gà
CKJo-B ggaagatctagaggactgacctaggacggtcagg CSCVHo-FL ggtcagtcctctagatcttccggcggtggtggcagctccggtgg tggcggttccgccgtgacgttggacgag CSCG-B ctggccggcctggccactagtggaggagacgatgacttcg gtcc CSCVK gtggcccaggcggccctgactcagccgtcctcggtgtc CSC-F gaggaggaggaggaggaggtggcccaggcggccctgact cag CSC-B Gaggaggaggaggaggaggagctggccggcctggccacta gtggagg