1: protein sau cảm ứng IPTG
Biểu hiện scFv ở một số điều kiện tối ƣu
Sau khi đã lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp, chủng E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa cho kháng thể scFv đƣợc biểu hiện với ở điều kiện đã lựa chọn (thời gian sau cảm ứng IPTG là 5 h, nồng độ IPTG là 0,6 mM, nồng độ OD600nm là 1,2 và nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, điện di kiểm tra kết quả (Hình 3.21). Băng protein ở kích thƣớc ~ 30 kDa xuất hiện rất đậm ở đƣờng chạy số 1 so với đƣờng số 2 mẫu không cảm ứng IPTG. Chứng tỏ chủng E. coli BL21 biểu hiện tốt ở các điều kiện nuôi cấy đã lựa chọn.
76
3.4.4. Tinh sạch kháng thể scFv đặc hiệu CD20 Lựa chọn phƣơng pháp tinh sạch Lựa chọn phƣơng pháp tinh sạch
Protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli chủ yếu tồn tại ở 2 dạng hòa tan và thể vùi. Vì vậy, trƣớc khi tiến hành tinh sạch protein, độ hòa tan của protein trong dung dịch phá màng tế bào E.coli đƣợc xác định để lựa chọn phƣơng pháp tinh sạch có hiệu quả. 1 ml dịch nuôi tế bào sau khi cảm ứng IPTG đƣợc li tâm thu cặn, cặn này đƣợc hòa lại bằng 500 µl dung dịch đệm và siêu âm khoảng 5-10 phút để phá vỡ tế bào. Thu 40 µl dịch vừa siêu âm (protein tổng số), dịch còn lại đem li tâm 1200 vòng/phút trong 15 phút thu 2 phần (phần hòa tan và phần cặn). Sau đó đem điện di protein tổng số, phần hòa tan và phần cặn, trên gel polyacrylamid để kiểm tra mức độ hòa tan của protein (Hình 3.22).
Kết quả điện di cho thấy protein tái tổ hợp xuất hiện ở các giếng: phần tổng số (4), phần hòa tan (3), phần cặn (2), còn giếng trƣớc cảm ứng (1) không xuất hiện băng protein kích thƣớc ~ 30 kDa. Điều này chứng tỏ protein tái tổ hợp kháng CD20 tồn tại ở cả 2 dạng hòa tan và thể vùi.
Sau khi xác định đƣợc độ hòa tan, kháng thể scFv đặc hiệu CD20 đƣợc tinh sạch theo phƣơng pháp không biến tính. Tuy nhiên, tinh sạch theo phƣơng pháp này không thu đƣợc protein có kích thƣớc ~ 30 kDa (Hình 3.23.A). Do vậy, kháng thể
Hình 3.22. Ảnh điện di mức độ hòa tan của kháng thể scFv tái tổ hợp
M: marker protein; 1: Trƣớc cảm ứng IPTG; 2: Phần cặn; 3: Phần hòa tan; 4: Phần tổng số 3: Phần hòa tan; 4: Phần tổng số
77
scFv lại đƣợc tinh sạch theo phƣơng pháp biến tính và trƣớc khi thu protein quan tâm từ cột Ni2+ protein đƣợc hồi tính bằng dịch đệm và điện di kiểm tra có xuất hiện băng protein quan tâm ~ 30 kDa (Hình 3.23.B). Phƣơng pháp biến tính đƣợc lựa chọn để tinh sạch kháng thể tái tổ hợp.
Tối ƣu nồng độ imidazol
6 histidine là một trong các đuôi phổ biến nhất đƣợc sử dụng để dễ dàng tinh sạch protein tái tổ hợp. Trong quá trình tinh sạch cột Ni2+ có thể gắn các protein không có đuôi histidine đặc hiệu do đó khi thu protein có thể lẫn protein đích với các protein không cần thiết. Thông thƣờng, các protein tạp có ái lực liên kết yếu hơn protein tái tổ hợp đích. Có một số cách để loại protein tạp, thứ nhất có thể tính toán lƣợng hạt Ni2+ vừa đủ để gắn với lƣợng protein đích, thứ hai imidazol có thể sử dụng nhƣ một tác nhân cạnh tranh [67].
Để loại bỏ những protein không quan tâm và thu đƣợc lƣợng kháng thể tinh sạch cao nhất, nồng độ imidazol đƣợc tối ƣu trong dải 100, 250, 350, 500 mM. Ở nồng độ 500 mM kháng thể kích thƣớc ~ 30 kDa xuất hiện rõ nhất; sau đó đến nồng độ 350 mM, ở các nồng độ 100 mM và 250 mM imidazol băng protein quan tâm xuất hiện mờ hơn (Hình 3.24). Vì vậy, nồng độ imidazol 500 mM đƣợc lựa chọn để thu protein khi tinh sạch.
Hình 3.23. Ảnh điện dikháng thể scFv tái tổ hợp tinh sạch biến tính (B) và không biến tính (A)
A: M: Maker protein; 3-7: Các phân đoạn thu protein, 1: trƣớc cảm ứng; 2: Sau cảm ứng B: 1-5: Các phân đoạn thu protein, 6: trƣớc cảm ứng
78
3.4.5. Khả năng liên kết của scFv với kháng thể cộng hợp Kết quả Dot blot Kết quả Dot blot
Dot blot là kĩ thuật đƣợc sử dụng để thăm dò các nucleotide và các kháng thể (nhƣ Western blot). Kĩ thuật này tiết kiệm thời gian và đơn giản nhƣ: không phải sắc kí hay điện di protein trên gel polyacrylamide và không có các bƣớc xử lí với gel. Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CD20 đƣợc gắn đuôi 6-histidin rất thuận lợi cho việc tinh sạch và thăm dò kháng thể tái tổ hợp [55].
Ở đây, Dot blot đƣợc sử dụng để xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv tái tổ hợp với kháng thể cộng hợp gắn đặc hiệu với đuôi 6-histidine trên màng PVDF (Hình 3.25). Ba mẫu protein tinh sạch (2, 3, 4) xuất hiện màu xám trên màng, mẫu đối chứng âm là nƣớc không xuất hiện màu chứng tỏ kháng thể scFv antiCD20 đã gắn đặc hiệu với kháng thể cộng hợp trên màng PVDF.
Hình 3.25. Hình ảnh Dot blot của kháng thể scFv đặc hiệu CD20
1: Đối chứng; 2 – 4: Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu CD20
Hình 3.24. Nồng độ imidazol thu kháng thể scFv khi tinh sạch