87
với kháng thể scFv tạo ra trƣớc đây (37oC) và các nghiên cứu của Chou [33], Peti [100] và Graslund [59].
Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn
Tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa) đƣợc nuôi hoạt hóa ở các thời gian là 1 h, 2 h, 3 h và 4 h. Sau đó, đo mẫu ở bƣớc sóng 600 nm để biết mật độ quang học. Kết quả đo OD600nm sau:1 h; 2 h; 3 h; 4 h nuôi hoạt hóa có giá trị OD600nm lần lƣợt là 0,3; 0,9; 1,3; 1,9. Tiếp tục bổ sung IPTG nồng độ 0,3 mM, thu mẫu sau 5 h cảm ứng ở 30oC.
Mật độ quang học không ảnh hƣởng rõ rệt đến mức độ biểu hiện kháng thể scFv-CH2 (Hình 3.34). Cả 4 đƣờng chạy 1-4 đều xuất hiện băng protein tái tổ hợp kích thƣớc ~ 43 kDa. Kết quả khảo sát nồng độ OD trƣớc khi cảm ứng để biểu hiện kháng thể scFv-CH2 khác với OD của kháng thể scFv (OD600 nm: 1,2). Mặt khác theo nghiên cứu của Francis và cộng sự (2010) nồng độ OD tốt nhất trƣớc cảm ứng là OD600nm: 0,6-0,9 [55]. Vì vậy, thời gian nuôi hoạt hóa trƣớc khi cảm ứng IPTG để biểu hiện scFv-CH2 đƣợc lựa chọn là 2h (OD600 nm: 0,9).
Hình 3.34. Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv-CH2 theo mật độ vi khuẩn
M: Marker; 5: Trƣớc cảm ứng IPTG; 1: 2: 3: 4: tƣơng ứng thời gian nuôi vi khuẩn trƣớc cảm ứng 4 h; 3 h; 2 h; 1 h trƣớc cảm ứng 4 h; 3 h; 2 h; 1 h
88
Ảnh hƣởng của thời gian cảm ứng IPTG
Tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy ở 30oC, nồng độ IPTG 0,3 mM và nuôi hoạt hóa trong 2 h trƣớc cảm ứng. Thu mẫu tại các thời điểm 2 h, 5 h và 15 h (nuôi qua đêm) sau cảm ứng.
Hàm lƣợng protein tái tổ hợp ~ 43 kDa thu đƣợc sau 2 h và 5 h cảm ứng ít hơn mẫu thu sau 15 h (Hình 3.35). Nhƣ vậy, thời gian cảm ứng tốt nhất của kháng thể scFv-CH2 (15 h) có sự khác biệt với kháng thể scFv (5 h). Điều này có thể do sự khác nhau về trình tự, kích thƣớc và vector biểu hiện kháng thể. Vì vậy, thời gian thu mẫu sau khi cảm ứng IPTG là 15 h đƣợc lựa chọn để biểu hiện kháng thể scFv- CH2.
3.5.4. Tinh sạch kháng thể scFv-CH2 Độ hòa tan Độ hòa tan
Trƣớc khi tinh sạch protein tái tổ hợp (kháng thể scFv-CH2), độ hòa tan của protein trong dung dịch phá màng tế bào E.coli đƣợc xác định để lựa chọn phƣơng pháp tinh sạch có hiệu quả (các bƣớc tiến hành thí nghiệm nhƣ phần xác định độ hòa tan của kháng thể scFv – mục 3.4.4).
Hình 3.35. Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv-CH2 theo thời gian