91
3.5.5. Độ ổn định của scFv-CH2tinh sạch
Kháng thể scFv-CH2 đƣợc bảo quản bằng cách đông khô trên máy trong 10 h. Sau đó đo hàm lƣợng scFv-CH2 (protein) trên máy Nanodrop ở các thời gian (1 ngày, 15 ngày, 30 ngày và 45 ngày) và nhiệt độ bảo quản (4oC, - 20oC, - 80oC) (Hình 3.39).
Hàm lƣợng kháng thể scFv-CH2 tạo ra đem đông khô sau 1 ngày kiểm tra còn nhiều ở các nhiệt độ bảo quản 4oC, -20oC, -80oC (1,72 mg/ml) (Hình 3.39), hàm lƣợng kháng thể giảm dần sau 15, 30 và 45 ngày khi bảo quản ở 4oC, -20oC . Tuy nhiên, khi bảo quản ở -80oC, hàm lƣợng kháng thể gần nhƣ không giảm sau 15, 30 và 45 ngày (tƣơng ứng 1,7; 1,7; 1,69 mg/ml). Thí nghiệm này cho thấy, hàm lƣợng scFv-CH2 giảm đi chậm hơn so với scFv ở các điều kiện bảo quản trên, có thể scFv- CH2 có cấu trúc lớn hơn và ít vị trí nhạy cảm với protease so với scFv.
Nhƣ vậy, so với kháng thể scFv tạo ra trƣớc đó thì kháng thể scFv-CH2 có tính ổn định cao hơn hẳn và bảo quản tốt nhất ở -80oC sau khi đông khô.
3.5.6. Khả năng liên kết của scFv-CH2 với CD20
Một số nhà khoa học đã sử dụng phƣơng pháp ELISA để xác định khả năng liên kết của kháng thể kháng CD20 tạo ra với CD20 trên tế bào lympho B ác tính dòng Raji hay dòng Daudi nhƣ Anna [18], Geng [56] và Fang [51].
Hình 3.39. Biểu đồ hàm lƣợng scFv-CH2 bảo quản ở nhiệt độ và thời gian khác nhau
92
Tƣơng tự, chúng tôi xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với CD20 bằng ELISA cạnh tranh. Phản ứng ELISA gồm có scFv-CH2, kháng nguyên CD20 tái tổ hợp thƣơng mại và tế bào ung thƣ máu dòng lympho B có biểu hiện CD20 (Raji) do Học viện Quân y cung cấp (hình 3.40A).
Kết quả ELISA cạnh tranh cho thấy, thí nghiệm 2 và 6 không có kháng thể scFv-CH2 xuất hiện màu và có giá trị OD450nm tƣơng ứng là 1,85 và 1,65. Các thí nghiệm 1, 5 (TN1, TN5) có kháng thể scFv-CH2 không xuất hiện màu (OD450nm
tƣơng ứng là 0,059 và 0,06) và 2 thí nghiệm đối chứng (TN3 và TN4) cũng không xuất hiện màu (OD450nm tƣơng ứng là 0,056 và 0,061) thấp hơn hẳn thí nghiệm 2 và 6 (Hình 3.40B). Nhƣ vậy, qua phản ứng ELISA có thể khẳng định kháng thể scFv- CH2 tạo ra có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20 thƣơng mại và CD20 trên tế bào lympho B ác tính dòng Raji.
Ở nghiên cứu của Anna và cộng sự [18], đoạn gen mã hóa scFv đƣợc tách dòng từ RNA của các tế bào lách chuột đã gây miễn dịch với CD20, đoạn gen mã hóa scFv-Fc đƣợc gắn vào vector biểu hiện pEE12. ScFv-Fc có khối lƣợng 104 kDa đƣợc biểu hiện, tinh sạch trên cột sắc kí ái lực protein A và có hoạt tính liên kết với
A B
Hình 3.40. Hình ảnh các tế bào lympho B và kết quả ELISA xác định khả năng liên kếtcủa kháng thể scFv-CH2 với CD20
A: Hình ảnh các tế bào lympho B biểu hiện CD20 ác tính dƣới kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 400 lần). tử (độ phóng đại 400 lần).
B:Biểu đồ kết quả ELISA xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với kháng nguyên CD20 thƣơng mại và CD20 trên tế bào lympho B (Raji). TN1 - TN6: kháng nguyên CD20 thƣơng mại và CD20 trên tế bào lympho B (Raji). TN1 - TN6: Thí nghiệm 1 – thí nghiệm 6
93
CD20 biểu hiện trên dòng tế bào Daudi. Geng và cộng sự đã tách dòng gen mã hóa scFv và gắn thêm đoạn CH2 và CH3, scFv-Fc có hoạt tính liên kết với CD20 biểu hiện trên dòng tế bào Raji và cấu trúc không gian 3 chiều của scFv-Fc có ảnh hƣởng đến khả năng liên kết với kháng nguyên CD20 [56].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tƣơng tự nghiên cứu của Anna và Geng và Fang là đã tạo đƣợc kháng thể tái tổ hợp dạng scFv-Fc và scFv-LDP kháng CD20 và kháng thể này có hoạt tính liên kết với CD20. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này gen mã hóa scFv đƣợc tách dòng từ RNA của tủy gà đã gây miễn dịch với CD20, gen mã hóa scFv-CH2 đƣợc gắn vào vector biểu hiện pET28a. ScFv-CH2 có khối lƣợng ~ 43 kDa đƣợc biểu hiện ở E. coli (BL21), tinh sạch trên cột sắc kí ái lực Ni2+ và có khả năng liên kết với CD20 thƣơng mại (SB) và CD20 trên dòng tế bào Raji.
3.6. THỬ NGHIỆM scFv-CH2 PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHL
3.6.1. Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot
Kháng nguyên CD20 có kích thƣớc khoảng 33–36 kDa [26], [48]. CD20 biểu hiện khoảng 85-90% ở bệnh NHL [52]. Theo các tác giả Thomas, Giles, Manshouri và Yang, CD20 đƣợc tìm thấy trong tủy sống và máu ngoại biên, huyết tƣơng và huyết thanh [57], [88], [118], [129].
Hiện nay, để có thể chẩn đoán sớm và đơn giản khi lấy mẫu xét nghiệm, ngoài ra có thể theo dõi sự tiến triển của bệnh trƣớc và sau khi điều trị thì một số nhà khoa học đã nghiên cứu xác định hàm lƣợng CD20 trong máu [15], huyết tƣơng [88] và huyết thanh bệnh nhân [57].
Trong thí nghiệm này, chúng tôi bƣớc đầu sử dụng kháng thể scFv-CH2 tạo ra để phát hiện CD20 có trong huyết thanh bệnh nhân NHL bằng phản ứng Western blot.
Trƣớc khi xác định ái lực của kháng thể scFv-CH2 với kháng nguyên CD20 trong huyết thanh thì huyết thanh của 3 bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin
94
(đã xét nghiệm hóa mô miễn dịch: CD20 dƣơng tính) đƣợc điện di để xem có xuất hiện protein kích thƣớc bằng kích thƣớc của CD20 hay không? (Hình 3.41).
Ba mẫu bệnh nhân NHL xuất hiện protein có kích thƣớc ~ 35 kDa, còn mẫu ngƣời bình thƣờng không thấy xuất hiện protein này. Nhƣ vậy khả năng protein này là kháng nguyên CD20.
Để khẳng định trong huyết thanh của 3 bệnh nhân NHL có kháng nguyên CD20 chúng tôi tiến hành 2 thí nghiệm Western blot song song:
1) Huyết thanh – scFv-CH2 – Kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidine
2) Huyết thanh – KTC (kháng thể kháng CD20 thƣơng mại) – Kháng thể cộng hợp kháng KTC
Phản ứng của huyết thanh với scFv-CH2 (thí nghiệm 1) và kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (thí nghiệm 2) đều xuất hiện băng có kích thƣớc ~ 35 kDa (Hình 3.42). Kết quả nghiên cứu cho thấy scFv-CH2 tạo ra đã phát hiện đƣợc CD20 trong 3 mẫu huyết thanh NHL và sơ bộ đánh giá kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyên CD20 tƣơng đƣơng với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại. Kết quả Western blot xác định CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin trong nghiên cứu này cũng tƣơng tự nghiên cứu xác định
Hình 3.41. Ảnh điện di huyết thanh bệnh nhân NHL