Mẫu máu bệnh nhân NHL Tách gen mã hóa kháng nguyên CD20
Tạo kháng nguyên CD20 tái tổ hợp Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20
Thu nhận gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu CD20 từ gà gây miễn dịch Tạo kháng thể scFv
Kết quả tổng hợp gen antiCD20 mã hóa scFv
Thiết kế vector biểu hiện pET- 22b(+)/antiCD20
Tối ƣu điều kiện biểu hiện scFv trong vector pET-22b(+).
Tinh sạch scFv
Xác định độ ổn định của scFv
Tạo kháng thể scFv-CH2
Tổng hợp gen antiCD20Fa mã hóa scFv-CH2
Sàng lọc hệ vector biểu hiện (pET28a, pET30GB1, MBP)
Tối ƣu điều kiện biểu hiện scFv-CH2 trong vector đã chọn (pET28a)
Tinh sạch scFv-CH2
Xác định độ ổn định của scFv-CH2
Khả năng liên kết của scFv-CH2 với CD20
Thử nghiệmscFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin
57
Hình 3.1. Ảnh điện di tách RNA tổng số từ bệnh phẩm
1-3: RNA tổng số tách từ máu của các bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TẠO KHÁNG NGUYÊN CD20 TÁI TỔ HỢP
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin Hodgkin
RNA tổng số đƣợc tách chiết bằng kit S.N.A.P (Invitrogen) và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, việc kiểm tra RNA trên gel agarose đánh giá sơ bộ độ tinh sạch của RNA. RNA tổng số sau khi tách chiết từ 3 mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân NHL đƣợc trình bày trên hình 3.1.
Ở ngƣời, các tiểu phần rRNA 28S; 18S; 5,8S là chủ yếu [87]. Do đó khi điện di RNA tổng số có thể xuất hiện 3 băng sáng hơn trên các đƣờng chạy điện di, tƣơng ứng với các tiểu phần rRNA. Kết quả điện di từ các mẫu đã tách chiết có xuất hiện 3 băng tƣơng ứng. Nhƣ vậy có thể khẳng định, RNA tổng số đã đƣợc tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm. Theo tính toán lí thuyết mRNA chiếm tỉ lệ nhỏ (2-8%) trong mẫu RNA tổng số [87] nhƣng cũng đủ để nhân bản gen quan tâm khi sử dụng phản ứng PCR phiên mã ngƣợc (RT - PCR) với RNA tổng số.
58
Hình 3.2. Ảnh điện di nhân bản gen mã hoá cho CD20 1: Marker DNA; 2: Sản phẩm RT-PCR nhân genCD20
3.1.2. Nhân bản gen mã hoá CD20
Sau khi có đƣợc RNA tổng số, DNA mang trình tự mã hóa cho CD20 đƣợc tạo ra bằng RT-PCR sử dụng kit “one-step RT-PCR” (Invitrogen) với cặp mồi đặc hiệu CD20F/CD20R chứa vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn NdeI và XhoI. Hai enzyme này đƣợc thiết kế nằm ở 2 đầu ngoài cùng để thuận lợi cho việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên CD20.
Điện di (Hình 3.2) cho thấy trên đƣờng chạy thứ 2 xuất hiện một băng sáng đậm, so với thang DNA chuẩn thì băng này nằm trong khoảng 750 bp và 1000 bp (1 kb). Kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết về độ dài của gen mã hoá cho CD20 dài khoảng 900 bp. Nhƣ vậy, gen mã hóa cho CD20 đã đƣợc nhân bản. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn cần phải tách dòng và xác định trình tự gen đã nhân bản và so sánh với trình tự các gen đã công bố trong GenBank.
3.1.3. Tách dòng gen mã hoá CD20
Sau khi nhân bản đoạn gen mã hóa cho CD20 và kiểm tra trên gel 1% agarose tiến hành tách dòng đoạn DNA này. Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng RT-PCR vào vector tách dòng pCR 2.1 (Invitrogen), sau đó biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng TOP10 và tách chiết DNA plasmid để chọn dòng tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa cho CD20.
59
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn NdeI và XhoI