Trên đĩa cấy trải chủng đã biến nạp xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng (có khả năng mang các vector tái tổ hợp) và một số khuẩn lạc xanh (chứa các plasmid tự đóng vòng). Vì vậy, để xác định dòng plasmid tái tổ hợp nào mang sản phẩm RT- PCR (gen CD20) cần phải cắt kiểm tra plasmid từ các khuẩn lạc trắng bằng các enzyme giới hạn NdeI và XhoI và so sánh kích thƣớc của đoạn cắt với sản phẩm RT-PCR.
Theo nhƣ thiết kế trên đoạn gen ngoại lai (gen CD20) đã có sẵn 2 vị trí nhận biết của NdeI và XhoI. Do đó, khi plasmid pCR2.1/CD20 đƣợc xử lí bằng NdeI và
XhoI, enzyme này cắt rời đoạn DNA ngoại lai khỏi vector tái tổ hợp.
Hai plasmid tách chiết từ 2 khuẩn lạc trắng đƣợc xử lí bằng enzyme giới hạn đều xuất hiện một đoạn DNA có kích thƣớc xấp xỉ 900bp (tƣơng đƣơng sản phẩm phản ứng RT-PCR) (Hình 3.3).
Nhƣ vậy, sản phẩm RT-PCR đã gắn đƣợc vào vector tách dòng pCR2.1. Tuy nhiên, để khẳng định gen mã hóa cho kháng nguyên CD20 đã đƣợc tách dòng thành công cần xác định trình tự nucleotide của sản phẩm RT-PCR.
3.1.4. Xác định trình tự gen mã hóa CD20
Dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc chọn để tách và tinh sạch gen mã hoá CD20 sau đó xác định trình nucleotide của gen này.
60
Sau khi phân tích và so sánh trình tự thu đƣợc với các trình tự đã công bố trong EMBL và GenBank (phụ lục 1.2), protein suy diễn tƣơng đồng với 9 trình tự từ 96,6% đến 100% trong đó có 1 trình tự tƣơng đồng 99,7% so với kháng nguyên CD20 của tế bào B với mã số P11836.
Nhƣ vậy, trình tự gen CD20 có chiều dài 900 bp đã đƣợc tách dòng thành công. Đây là giai đoạn rất quan trọng để thực hiện các công việc tiếp theo trong đề tài. Dựa trên trình tự đoạn gen CD20 đã thu để thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên CD20.
3.1.5. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên CD20
Vector pET-21a(+) đƣợc chọn làm hệ vector biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên CD20. Vector này có chứa 1 đoạn 6 amino acid histidin rất thuận tiện cho việc thu và tinh sạch protein tái tổ hợp.
Đoạn gen CD20 và vector pET-21a(+) mở vòng đƣợc thu hồi theo kit của QIAGEN (Hình 3.4). Trên ảnh điện di cho thấy đoạn gen CD20 (~ 900 bp) và vector pET-21a(+) mở vòng đã thu đạt nồng độ và độ tinh sạch cần thiết cho phản ứng ghép nối để tạo vector tái tổ hợp pET-21a(+)/CD20.
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm cắt và tinh sạch gen CD20, vector pET-21a(+)