61
Để kiểm tra xem vector biến nạp vào E. coli DH5 có chứa đoạn gen ngoại lai hay chƣa thì lấy ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc đem tách plasmid sau đó cắt bằng NdeI và XhoI (Hình 3.5). Trên 3 đƣờng chạy 1, 2, 3 đều xuất hiện 2 băng có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc của pET-21a(+) và CD20. Nhƣ vậy, khả năng lớn là vector tái tổ hợp có chứa đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên CD20.
Tuy nhiên, để khẳng định đoạn gen CD20 đã đƣợc đƣa vào vector biểu hiện pET-21a(+) đúng khung đọc, không xuất hiện lỗi trong khi sao chép DNA thì cần phải xác định trình tự nucleotide đoạn gen ngoại lai gắn vào vector pET-21a(+). Trình tự nhân đƣợc, sau khi xử lí bằng phần mềm Bioedit và Gendoc thể hiện đúng với những tính toán lí thuyết (trình tự nucleotide của gen mã hóa CD20 trình bày ở phụ lục 1.3). Nhƣ vậy, vector tái tổ hợp pET-21a(+)/CD20 hoàn toàn có đủ khả năng biểu hiện trong tế bào E. coli.
3.1.6. Biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của CD20 Biểu hiện gen CD20 trong E. coli BL21 (DE3) Biểu hiện gen CD20 trong E. coli BL21 (DE3)
Vector pET-21a(+)/CD20 đƣợc biến nạp vào chủng E. coli BL21 để tạo ra protein tái tổ hợp (kháng nguyên CD20). Kết quả biểu hiện gen CD20 thể hiện trên Hình 3.6. Mẫu sau cảm ứng có xuất hiện 1 băng protein có kích thƣớc nằm trong khoảng 25 đến 35 kDa (~ 33 kDa) và khác biệt so với mẫu trƣớc cảm ứng. Từ kết
Hình 3.5. Ảnh điện di plasmid và sản phẩm vector pET-21a(+) mang CD20 M: Marker DNA (1 kb Fermentas); A: 3 dòng plasmid tái tổ hợp (pET21a(+)/CD20)
62
quả này có thể thấy rằng đoạn gen mã hóa cho CD20 đã biểu hiện thành công ở tế bào E. coli BL21 (DE3).
Tinh sạch kháng nguyên CD20
Do kháng nguyên CD20 tái tổ hợp có đuôi ái lực 6-histidine nên các protein này có khả năng liên kết Ni2+ trên cột sắc kí ái lực ion. Kháng nguyên CD20 đƣợc tinh sạch bằng Kit ProbondTM của hãng Invitrogen, sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra trên gel polyacrylamide (Hình 3.7). Kết quả điện di thu đƣợc 1 băng protein đặc hiệu có kích thƣớc ~33 kDa, chứng tỏ protein tái tổ hợp (kháng nguyên CD20) đã đƣợc tinh sạch.
Hình 3.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp (kháng nguyên CD20) bằng cột sắc kí ái lực Ni2+ M: Marker protein; 1: protein tổng số trƣớc khi tinh sạch
2-4: Các phân đoạn thu kháng nguyên CD20
Hình 3.6. Ảnh điện di kháng nguyên CD20 trong E. coli BL21
63
Để khẳng định protein tái tổ hợp tinh sạch qua cột sắc kí ái lực Ni2+ chắc chắn là kháng nguyên CD20 cần tiến hành phản ứng lai Western blot xác định hoạt tính liên kết của kháng nguyên CD20 với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (Hình 3.8). Ở đƣờng số 1 xuất hiện 1 băng kích thƣớc nằm trong khoảng 25 đến 35 kDa bằng kích thƣớc của kháng nguyên CD20, ở đƣờng số 2 là mẫu đối chứng âm (không có protein sau tinh sạch) không có băng nào. Nhƣ vậy, kết quả Western blot cho thấy protein sau tinh sạch là kháng nguyên CD20 và có khả năng liên kết với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (abcam).
Zhang và cộng sự đã tách dòng CD20 thành công từ dòng tế bào Daudi, gắn vào vector pTIG Trx và biểu hiện ở E. coli (BL21), tinh sạch qua cột sắc kí ái lực Ni2+ và xác định đƣợc hoạt tính của CD20 bằng Western blot [130]. Ngoài ra, Anbouhi và cộng sự (2012) đã tách dòng gen mã hóa vùng ngoại bào CD20 thành công từ plasmid tái tổ hợp pORF9-hCD20a (Invivogen, USA), gắn vào vector pET32a(+) và biểu hiện ở E. coli (OrigamiTM), CD20 có khối lƣợng 30 kDa đã tinh sạch và xác định đƣợc hoạt tính liên kết với kháng thể kháng CD20 bằng phản ứng ELISA và Western blot [17].
Hình 3.8. Kết quả Western blot của kháng nguyên CD20 với kháng thể thƣơng mại