- Khĩ đánh giá sự dung nạp
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ XỬ LÝ HAM THÀNH MÀNG COLLAGEN
THÀNH MÀNG COLLAGEN
2.1. Cơ sở khoa học
Về cấu trúc, màng ối bao gồm một lớp đơn tế bào biểu mơ, một lớp màng cơ bản và một lớp nền. Biểu mơ nguyên vẹn của màng ối sẽ cản trở sự tăng sinh đồng nhất của các tế bào nuơi và cĩ thể làm giảm sự hình thành các phức hợp bám dính như thể bán liên kết (hemidesmosome) với màng cơ bản. Màng cơ bản khơng chỉ cĩ vai trị như là giá thể cơ học mà cịn chứa các protein chủ yếu hoạt động như là các nhân tố điều hịa hình thái, tăng trưởng, tăng sinh, biệt hĩa đồng thời ngăn ngừa apoptosis biểu mơ. Do đĩ, việc loại bỏ các tế bào biểu mơ màng ối cĩ vai trị quan trọng để cho phép các tế bào nuơi tương tác với màng cơ bản bên dưới. Màng cơ bản của màng ối dày khoảng 200 – 300nm.
2.2. Phương pháp thực hiện 2.2.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu: 2.2.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu:
Nơi thu mẫu: Bệnh viện Phụ sản Hùng Vương, Thành phố Hồ Chí Minh (i) Thu của sản phụ tình nguyện
(ii) Thu nhận trong điều kiện phẫu thuật sau mổ bắt con
(iii) Bệnh nhân đã cĩ kết quả xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai
(iv) Thai đủ tháng (38 – 40 tuần)
(v) Nước ối trắng đục, khơng cĩ dấu hiệu nhiễm trùng (vi) Mẹ khơng cĩ dấu hiệu nhiễm trùng trong lúc mổ bắt con (vii) Khơng bị vỡ ối sớm
2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ:
(i) Sản phụ khơng đồng ý cho màng ối
(ii) Sản phụ cĩ các bệnh lý trước sinh như: bệnh lao, bệnh ung thư, … và các tai biến lúc chuyển dạ
(iii) Một trong các xét nghiệm HIV, HBV, HCV, giang mai dương tính (iv) Thai thiếu tháng hoặc quá ngày
Tổng số mẫu màng ối đã thu nhận: 60 mẫu
2.2.3. Phương pháp thu nhận mẫu màng ối
- Ngay sau khi sản phụ được mổ lấy con, HAM được lột nhanh ra khỏi bánh nhau trong điều kiện vơ trùng của phịng mổ.
- Mẫu HAM được giữ trong dung dịch DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) cĩ kháng sinh (penicillin 1000U/ml, streptomicin 1000µg/ml) trong thùng
25 chứa đá gel lạnh 2oC – 8oC và chuyển về phịng thí nghiệm, thao tác trong vịng 4 giờ.
2.2.4. Phương pháp loại tế bào biểu mơ màng ối
- Mẫu HAM vừa thu nhận cĩ lẫn rất nhiều máu và chất nhầy.
- Rửa, lắc HAM trong dung dịch DPBS-kháng sinh cho đến khi sạch máu - Chuyển HAM sang lọ khác và lắc trong dung dịch Trypsin-EDTA 0,05% trong 15 phút, 30 phút, 45 phút ở 370C với tốc độ 200 vịng/phút.
- Cạo bỏ lớp tế bào biểu mơ HAM, cạo nhẹ nhàng tránh làm vỡ màng đáy - Rửa bằng PBSA
- Đánh giá hiệu quả bĩc tách lớp tế bào biểu mơ từ HAM bằng phương pháp nhuộm hematoxylin và eosin (nhuộm H&E) và chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscopy).
- Chọn phương pháp loại biểu mơ HAM thích hợp.
- Màng ối sau khi xử lý được xác định thành phần collagen bằng phương pháp nhuộm PAS và Trichrom tại Khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Chợ Rẫy.
- Kết quả đánh giá tế bào biểu mơ cịn lại trên HAM được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét Jeol – Nhật bản (LSM - 5300) tại Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ Quốc gia – Hà Nội.
Sau đĩ, màng collagen được bảo quản bằng hai phương pháp: (i) để khơ tự nhiên trong tủ cấy; (ii) đơng lạnh ở -80oC. Đối với phương pháp bảo quản bằng cách để khơ tự nhiên trong tủ cấy: màng collagen được để trong tủ cấy và thổi khơ tự nhiên (khoảng 2 giờ). Đối với phương pháp bảo quản bằng cách đơng lạnh ở - 80oC: màng collagen được bảo quản trong glycerol 15%.
Màng collagen được đĩng gĩi và khử trùng bằng chiếu xạ tia từ nguồn Co60, suất liều 25 kGy tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai cơng nghệ bức xạ Thành phố Hồ Chí Minh.
Màng collagen đã bảo quản bằng phương pháp lạnh sâu (-80oC) và khơ tự nhiên được đánh giá độ an tồn cho thử nghiệm lâm sàng (Kích ứng da, Giới hạn nhiễm khuẩn, Độc tính bất thường qua da theo tiêu chuẩn của Bộ y tế tại Viện Kiểm nghiệm thuốc – Thành phố Hồ Chí Minh) và cho nuơi cấy tế bào (độ thay đổi pH mơi trường nuơi).
26
Hình 2.15. Quy trình xử lý màng ối. Màng ối vừa được thu nhận từ bệnh viện
(A), màng ối đã được rửa sạch máu (B), màng ối sau khi xử lý trypsin-EDTA để loại biểu mơ (C), màng collagen được trải lên đĩa lồng (D).
2.2.5. Phương pháp trải màng collagen trên đĩa nuơi
- Cắt màng collagen thành những mảnh cĩ diện tích tương ứng bề mặt đĩa nuơi.
- Trải căng và áp sát màng collagen trên bề mặt đĩa nuơi (đĩa lồng - insert) sao cho mặt biểu mơ hướng lên trên.
- Bảo quản bằng cách: (i) để khơ tự nhiên trong tủ cấy; (ii) đơng lạnh ở -80oC. - Đĩng gĩi và khử trùng bằng chiếu xạ tia từ nguồn Co60
, suất liều 25 kGy tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai cơng nghệ bức xạ Thành phố Hồ Chí Minh. - Chọn phương pháp bảo quản thích hợp.
2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính màng collagen Độ an tồn của màng collagen Độ an tồn của màng collagen
Màng collagen được gửi đánh giá về: Kích ứng da, Giới hạn nhiễm khuẩn, Độc tính bất thường qua da theo tiêu chuẩn của Bộ y tế tại Phân Viện Kiểm nghiệm – Thành phố Hồ Chí Minh.
Ảnh hưỏng của màng collagen đến pH mơi trường nuơi tế bào
- Cắt màng collagen thành miếng 1cm x 1cm (110 miếng)
- Cho 1ml mơi trường SFM vào mỗi giếng của các đĩa 4 giếng (110 giếng) - Đặt mỗi miếng màng vào 1 giếng
- Thay mơi trường sau mỗi 48 giờ
- Đo pH sau mỗi 12 giờ, kéo dài trong 7 ngày, đo 3 lần x 5 mẫu cho mỗi phương pháp bảo quản
D C C
27
NỘI DUNG 2: