- Khĩ đánh giá sự dung nạp
PHÂN LẬP, NUƠI CẤY VÀ TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG 2.3 Cơ sở khoa học
2.5. PHƯƠNG PHÁP TẠO TẤM NHIỀU LỚP TẾ BÀO SỪNG 1 Phương pháp nuơi tế bào sừng trên màng collagen
2.5.1. Phương pháp nuơi tế bào sừng trên màng collagen
Trải màng collagen trên đáy của đĩa lồng
Cấy chuyền tế bào sừng lên màng collagen với mật độ 104 tế bào/cm2 Ủ ở 37oC, 5% CO2
Thay mơi trường bên ngồi và bên trong đĩa lồng mỗi 2 ngày/lần
Đánh giá sự tăng trưởng của tế bào mỗi ngày dưới kính hiển vi đảo ngược và phương pháp MTT.
Phương pháp MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) được dùng để khảo sát khả năng tăng sinh của tế bào trong nuơi cấy in
vitro.
MTT cĩ màu vàng. Khi đi vào trong tế bào, MTT sẽ bị enzym dehydrogenase của ty thể chuyển hĩa (khử) thành tinh thể formazan cĩ màu tím. Q trình khử này chỉ xảy ra khi enzym khử của ty thể cĩ hoạt tính. Do đĩ, sự chuyển hĩa liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống.
Sau đĩ, tinh thể formazan này được hịa tan trong dung dịch DMSO/ethanol hoặc dung dịch SDS pha trong HCl tạo thành dung dịch cĩ màu. Dung dịch màu này được xác định mật độ quang OD ở bước sĩng 500-600 bằng quang phổ kế. Giá trị OD đo được ở những mốc thời gian khác nhau giúp ta xác định số lượng tế bào hoặc sự tăng, giảm tế bào tại các mốc trên [88].
Phương pháp MTT được tiến hành như sau: - Loại bỏ mơi trường cũ
- Thêm 1ml mơi trường mới vào đĩa lồng. Bổ sung thêm vào mỗi đĩa 100l dung dịch MTT 5mg/ml.
- Ủ 3 giờ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
- Sau khi ủ, loại hết mơi trường cĩ MTT, bổ sung 1ml dung dịch hịa tan tinh thể DMSO/ethanol vào trong mỗi đĩa.
31 - Sau đĩ, hút hết dung dịch hịa tan vào ống cuvet, đo mật độ quang ở
bước sĩng 545nm