- Bệnh nhân được xuất viện vào ngày 6/9/13, sau hơn 55 ngày tiến hành điều trị (N55).
QUY TRÌNH TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG Cơ sở khoa học
Cơ sở khoa học
Tế bào sừng chiếm 90% tổng số tế bào của lớp biểu bì da. Tế bào gốc biểu bì là một dạng tế bào sừng cĩ tính gốc, chúng cĩ khả năng tự đổi mới khơng cĩ giới hạn và tạo ra những tế bào con cĩ khả năng biệt hĩa cuối cùng. Lớp đáy của biểu bì cĩ 10% tế bào gốc biểu bì (epidermal stem cell), 50% các tế bào khuếch đại chuyển ở thời điểm giao thời của sinh trưởng (transient amplifying cell), 40% các tế bào ở hậu kỳ của gián phân (postmitotic cell).
Sau khi nuơi cấy trong phịng thí nghiệm, tế bào sừng được ghép lên cơ thể bệnh nhân. Cĩ hai dạng tự ghép tế bào sừng nuơi cấy là dạng tấm hoặc huyền phù. Hai dạng này cĩ thể được phân biệt dựa vào phương pháp thu hoạch, xử lý và ứng dụng tế bào lên nền vết thương.
Trong phương pháp huyền phù, các tế bào được thu hoạch và xử lý trong suốt quá trình tái cấu trúc vết thương ở bệnh nhân. Các tế bào này được đưa vào nền vết thương trong một dung dịch (mơi trường hoặc fibrin) bằng cách sử dụng bình phun. Dung dịch này thường bao gồm các tế bào sừng cơ bản, tế bào hắc sắc tố, nguyên bào sợi với tỷ lệ khơng ổn định. Tuy nhiên, cĩ những vấn đề về sinh học tế bào và phương pháp ghép cần được quan tâm. Các tế bào sừng chỉ ổn định trong dung dịch trong một thời gian ngắn trước khi bắt đầu chịu sự biệt hĩa cuối cùng. Watt và cs. đã mơ tả những thay đổi nhanh chĩng (trong vịng 4 giờ) sự biểu hiện integrin khi các tế bào sừng được đặt trong huyền phù. Do đĩ, vấn đề khĩ khăn là phải dự trữ và vận chuyển các tế bào sừng trong huyền phù với thời gian ngắn. Ngồi ra, các bác sĩ phẫu thuật và y tá chăm sĩc vết thương cần phải học kỹ thuật phun tế bào sao cho đều khắp nền vết thương. Đối với các vết thương rộng, đây là một thử thách.
Trong phương pháp tạo tấm, các tấm tế bào cĩ thể được nuơi cấy trong 3 – 5 tuần sau khi lấy da và sau đĩ ứng dụng ghép vào vết thương. Các tế bào sẽ được chuyển lên màng để giảm thời gian thao tác trong phịng thí nghiệm. Tuy nhiên, các tấm tế bào sừng nuơi cấy thường gồm 3-5 lớp tế bào và rất khĩ cầm giữ. Do đĩ, cần cĩ một cơng cụ để thao tác tấm tế bào này.
Tỷ lệ dung nạp mảnh ghép thay đổi lớn, từ 0% đến hơn 80% ở người trưởng thành và 50% ở trẻ em. Cĩ một số lý do để giải thích tỷ lệ dung nạp mảnh ghép bị thay đổi. Một trong những giả thiết được tin tưởng nhất là do cấu trúc bất thường của các tơ neo dưới điều kiện nuơi cấy và do các tấm được xử lý enzyme để tách ra khỏi chai nuơi trước khi ghép. Để khắc phục vấn đề này, một số vật liệu đã được sử dụng để mang tấm tế bào sừng như màng collagen loại 1 của bị, pHEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate)), PIAAm (N-Isopropylacryamide), PPS (plasma polymerised functional surface).
Màng cơ bản của màng ối cĩ cấu trúc giống màng cơ bản của da nên đây là vật liệu lý tưởng để mang tấm tế bào sừng.
Tấm tế bào sừng nuơi cấy là tấm gồm nhiều tầng tế bào được tạo ra in vitro.
Phương pháp tạo tấm tế bào sừng nuơi cấy gồm những giai đoạn sau: (i) thu nhận mơ da; (ii) phân lập và nuơi cấy để tăng sinh tế bào sừng từ mơ da; (iii) tạo nhiều tầng tế bào sừng.
Vật liệu – hĩa chất Hố chất:
- Dung dịch PBS ( khơng chứa ion Ca2+ và Mg2+ ), PBS 10X, pha lỗng với nuớc cất 10 lần để đuợc PBS 1X, hấp vơ trùng ở 1210C, 1atm trong 20 phút; bảo quản ở nhiệt độ phịng
- Dung dịch Trypsin 2.5% pha lỗng với nước cất 10 lần để đuợc Tryspsin 0.25%. Lọc vơ trùng bằng màng lọc 0.2um. Bảo quản ở 40C
- Dung dịch EDTA 0.02%. Lọc vơ trùng bằng màng lọc 0.2um. Bảo quản ở 40C - Kháng sinh : Penilline/Streptomycine 200X. Lọc vơ trùng bằng màng lọc 0.2um.
Bảo quản ở 40C
- Ding dịch HEPES 1M, bảo quản ở 40C
- Huyết thanh bào thai bị(FBS). Bảo quản ở -200C - Yếu tố tăng trưởng EGF. Bảo quản ở -200C
- Độc tố vi khuẩn tả (Cholera Toxin). Bảo quản ở -200
C - Dung dịch Hydeocortisone. Bảo quản ở -200C
- Trypan blue 0.4%
-
Cồn 700 - Povidine
- Mơi trường nuơi sơ cấp PCM. Lọc vơ trùng bằng màng lọc 0.2um, bảo quản ở 40 C - Thành phần gồm: Hố chất Nồng độ HEPES 20Mm FBS 20% EGF 10ng/ml Hydrocortisone 0.4ng/ml Cholera Toxin 10-9M Penicilline 100U/ml Streptimycine 100ug/ml
- Dung dịch Defined Keratinocytes 1X, SFM
Dụng cụ:
- Kẹp cong và thẳng - Kéo cong và thẳng
- Cán dao phẫu thuật No 22 - Luỡi dao phẫu thuật No 4 - Găng tay phẫu thụât vơ trùng - Găng tay sạch
- Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 10cm, 4cm - Đĩa nuơi tế bào 6 giếng
- Đĩa nuơi cấy upcell 10cm - Đĩa insert 0.4um
- Chai nuơi tế bào 25cm2
- Pipetteman (1-10ul, 10-100ul, 100-1000ul, 1-10ml) - Ống ly tâm 15ml
- Màng lọc 0.2um
- Buồng đếm Naubauer cải tiến - Lame, lamelle
- Becher 50, 100, 250ml - Bình xịt cồn
- Đầu tip 100ul, 1000ul, 10ml - Eppendorf
- Màng parafilm - Bơm tiêm 10ml
- Pipette pasteur thủy tinh - Khẩu trang
Quy trình tạo tấm tế bào sừng người trong mơi trường khơng huyết thanh:
- Mẫu da được thu nhận trong DPBS – kháng sinh. Sau khi vận chuyển về phịng thí nghiệm tiến hành thao tác ngay.
- Đo diện tích mẫu da bằng thước đo vơ trùng.
- Rửa mẫu da với Povidine 10% trong 5 phút. Vì mẫu da được lấy từ bệnh nhân bị bỏng nên khả năng nhiễm khuẩn cao. Việc rửa Povidine giúp ngăn ngừa nhiễm khuẩn.
- Rửa mẫu da lại bằng DPBS 2 lần, loại bỏ lơng, mỡ, một phần lớp trung bì.
- Cắt thành từng mảnh nhỏ 1x1 cm. Sử dụng lamen tiệt trùng để đè lên các mảnh da. Việc sử dụng lamen làm giảm tối đa các mảnh da bị cuốn lại trong quá trình ủ trypsin-EDTA và thời gian ủ cũng giảm nhiều.
- Ủ trong trypsin 0,25% - EDTA 0,02% (tỷ lệ 1 - 4) 15 giờ, 4o
C.
- Tách rời lớp biểu bì và lớp trung bì. Dùng phương pháp cạo cơ học để tách các tế bào sừng ra khỏi mảnh trung bì.
- Dùng mơi trường nuơi sơ cấp để huyền phù và thu nhận tế bào sừng rời
- Tiến hành đếm tế bào bằng phương pháp nhuộm trypan blue. Tính tốn số lượng tế bào sao cho diện tích mẫu thu được sau nuơi cấy gấp 20 lần diện tích ban đầu. - Cấy tế bào lên màng collagen đã được trải trên đĩa lồng với mật độ tối thiểu 104 tế
bào/cm2
- Nuơi tế bào trong mơi trường sơ cấp ở 37o
C, 5% CO2
- Sau 2 ngày nuơi cấy, thay mơi trường sơ cấp bằng mơi trường khơng huyết thanh - Thay mơi trường bên trong và bên ngồi đĩa lồng mỗi 2 ngày/lần
- Sau 10 ngày tế bào đạt lớp đơn trên màng collagen
- Nâng lên bề mặt khơng khí: hút hết mơi trường trong đĩa lồng ra - Thay mơi trường bên ngồi đĩa lồng mỗi ngày, kéo dài 5 ngày
Như vậy: Việc sử dụng lamen trong quá trình ủ mẫu da và việc cấy trực tiếp tế bào sừng lên màng collagen giúp giảm thời gian nuơi cấy từ 21 ngày xuống 15 ngày nhằm đáp ứng nhu cầu ghép nhanh cho bệnh nhân bị bỏng. Diện tích tấm tế bào sừng sau nuơi cấy tăng 20 lần so với mảnh da thu nhận ban đầu từ bệnh nhân.
Đánh giá kết quả:
Sau 15ngày nuơi cấy đánh giá hình ảnh mơ học sự bám dính và phát triển tế bào sừng trên màng ối.
Nhuộm HE: mẫu duơng tính khi tế bào hình đa diện cĩ bào tương bắt màu hồng, nhân bắt màu tím đậm, trên nền màng ối bắt màu hồng đồng nhất
Nhuộm p63:mẫu dương tính khi tế bào hình đa diện cĩ bào tuơng bắt màu nâu, nhân tế bào bắt màu xanh dương
Quan sát hình ảnh các mối liên kết giữa tế bào – tế bào, tế bào – màng collagen bằng kỹ thuật chụp TEM, SEM.
Kết luận:
Với quy trình trên, sau 15 ngày nuơi trực tiếp tế bào sừng trên màng ối trong đĩa lồng, đã tạo đuợc tấm tế bào sừng trên màng ối. Bỏ qua giai đoạn cấy chuyền từ giai đoạn sơ cấp lên F1 và F2 trong chai nuơi, cũng như bỏ qua giai đoạn chuyển tế bảo ở chai nuơi 25cm2 sang đĩa lồng. Đồng thời giảm tỷ lệ nhiễm trong giai đoạn nuơi tế bào và cấy chuyền.
Trong số 14 truờng hợp lấy da tự thân để ghép da, theo báo cáo cĩ 4 trường hợp ghép da thành cơng chiếm tỷ lệ 28%, các truờng hợp cịn lại do da tự lành truớc khi ghép và một số cĩ tình trạng nhiễm trùng nặng truớc khi tiến hành ghép da nên khĩ đánh giá được quá trình ghép.