- Khĩ đánh giá sự dung nạp
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN NỘI DUNG 1:
3.1. Kết quả tạo màng collagen
Ở màng ối tươi, mặt biểu mơ cĩ thể được phân biệt với mặt màng đệm bằng mắt thường. Mặt màng đệm nhày, nhớt, trong khi mặt biểu mơ nhám, bằng phẳng. Đây là đặc điểm để chọn đúng mặt biểu mơ trong việc loại tế bào và cố định màng collagen trên đĩa lồng với mặt màng cơ bản bên trên giúp tế bào nuơi dễ dàng bám dính.
Hình 3.18. Lớp tế bào biểu mơ nguyên vẹn của màng ối (nhuộm giemsa, 40X).
Sau khi thu nhận, lớp tế bào biểu mơ của màng ối được loại bỏ bằng cách xử lý trypsin/EDTA và cạo. Kết quả đánh giá hiệu quả loại tế bào biểu mơ màng ối thơng qua nhuộm H&E và chụp dưới kính hiển vi điện tử quét được trình bày qua Hình 3.19. và Hình 3.20.
Hình 3.19. Tạo màng collagen từ màng ối người. Màng ối nguyên vẹn (a), màng
ối được xử lý trypsin-EDTA 30 phút (b) và cạo để loại biểu mơ (nhuộm H&E, 100X).
38
Hình 3.20. Ảnh chụp SEM của màng collagen. Màng ối đã được xử lý trypsin-
EDTA 30 phút và cạo để loại biểu mơ (SEM). Các kết quả từ Hình 1.3 và Hình 1.4 cho thấy:
(i) Ở màng ối nguyên vẹn, một lớp tế bào biểu mơ lợp đều đặn trên mặt.
(ii) Ở màng ối được xử lý trypsin/EDTA 30 phút và cạo, tế bào biểu mơ đã được loại bỏ hồn tồn.
Sau khi xử lý để loại biểu mơ, thành phần collagen của màng ối được đánh giá thơng qua nhuộm trichrom và nhuộm PAS.
Hình 3.21. Ảnh nhuộm mơ học màng collagen. Kết quả nhuộm trichrom (A) và
nhuộm PAS (B) của màng ối đã loại biểu mơ.
BÀN LUẬN:
Màng ối loại biểu mơ đã được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu cũng như ứng dụng lâm sàng, đặc biệt ứng dụng trong nuơi cấy tế bào vùng rìa giác mạc và tế bào niêm mạc má để điều trị các bệnh về nhãn cầu. Trong các cơng trình đã được cơng bố, lớp tế bào biểu mơ màng ối đã được loại bỏ theo nhiều phương
B A
39 pháp khác nhau như xử lý trypsin/EDTA 30 phút và cạo; xử lý dispase II trong 15 phút và rửa; xử lý dispase II trong 25 phút và cạo; xử lý EDTA trong 2 giờ; xử lý Tris nhược trương chứa EDTA, aprotinin và SDS, DNase trong 43 giờ; xử lý trypsin/EDTA trong 24 giờ, Triton X-100 trong 24 giờ; xử lý thermolysin trong 9 phút và cạo.
Trong các kết quả thu nhận được (Hình 1.3 và Hình 1.4), việc xử lý với trypsin/EDTA trong 30 phút và cạo để loại tồn bộ lớp tế bào biểu mơ của màng ối là quy trình thích hợp trong nghiên cứu này. Ưu điểm của phương pháp này là: (i) thời gian xử lý tương đối ngắn so với một số quy trình đã được cơng bố; (ii) đơn giản, dễ thực hiện; (iii) trypsin/EDTA cũng là hĩa chất được sử dụng để thu nhận tế bào sừng từ mơ da, giúp hạn chế sử dụng nhiều loại hĩa chất trong thí nghiệm. Tỷ lệ thành cơng của phương pháp này là 100% (cả 30 mẫu màng ối sau xử lý đều cho kết quả tương tự).
Kết quả từ Hình 1.4. cho thấy, sau khi được loại bỏ tồn bộ lớp tế bào biểu mơ, thành phần thu được từ màng ối chứa chủ yếu là collagen, được chỉ thị bằng mật độ màu đặc trưng của sợi collagen sau khi nhuộm trichrom và nhuộm PAS trên tổng diện tích được nhuộm.
Sau khi xử lý, trung bình một màng ối cĩ thể cho ra 750cm2 màng collagen được trải lên đĩa nuơi. Như vậy, tổng diện tích màng collagen đã tạo được là 2,2m2.