- Khĩ đánh giá sự dung nạp
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG ỨNG DỤNG GHÉP TỰ THÂN
3.2. Kết quả phân lập, nuơi cấy, nhân khối tế bào sừng từ mơ da
Sau khi ủ trypsin/EDTA, lớp biểu bì và trung bì được tách rời dễ dàng bằng kẹp. Các tế bào của lớp biểu bì được tách rời bằng cách huyền phù trong mơi trường nuơi.
Hình 3.22. Tách tế bào sừng khỏi phần trung bì. Lớp biểu bì và trung bì tách
rời nhau sau khi ủ enzyme.
Trypsin là enzyme thường được sử dụng để phân lập các tế bào sừng từ mẫu da. EDTA cĩ tác dụng tách rời các cụm tế bào thành tế bào đơn. Ngồi ra, việc sử dụng EDTA cũng giúp loại nguyên bào sợi từ hỗn hợp tế bào sừng nuơi cấy.
Kết quả nhuộm mơ học biểu bì và trung bì tách rời được trình bày trong Hình 3.24.
Biểu bì
45 Tế bào tách rời được xác định tỷ lệ % sống sau khi nhuộm trypan blue. Chỉ những tế bào sống mới cĩ thể bám và tăng sinh in vitro. Do đĩ, phần trăm tế bào sống trong tổng số tế bào đếm phải được xác định. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Số tế bào sống và % tế bào sống sau khi phân lập.
Mẫu STB sống x 104/ cm2 da % tế bào sống Mẫu STB sống x 104/ cm2 da % tế bào sống 1 640 71,54 10 558 91,20 2 650 75,75 11 779 76,83 3 574 71,84 12 809 81,31 4 616 77,40 13 507 97,30 5 754 71,60 14 517 97,50 6 695 82,83 15 666 86,70 7 686 80,25 16 666 84,30 8 636 87,26 17 754 87,78 9 657 83,10 18 651 85,00 Ghi chú: STB – số tế bào BÀN LUẬN
Hỗn hợp tế bào tách được từ mơ da khi sử dụng phương pháp trypsin lạnh chứa phần lớn là tế bào sừng (là đối tượng chính cần thu nhận), ngồi ra cịn cĩ lẫn nguyên bào sợi trung bì, tế bào hắc sắc tố, tế bào Langerhans, tế bào Merkel. Để
Hình 3.23. Ảnh nhuộm mơ học phần biểu bì và trung bì sau khi tách bằng enzyme. Mơ
học biểu bì đã tách rời (A), mơ học trung bì đã tách rời. (B), mơ học trung bì tách rời đã được thu nhận hồn tồn tế bào lớp đáy. (C), phần trung bì sau khi loại bỏ biểu bì (H&E)
A B
Tế bào lớp đáy
Trung bì
Trung bì
46 tiến hành các thí nghiệm tiếp theo, các tế bào sừng cần được tách rời ra khỏi quần thể tế bào cịn lại. Cĩ nhiều cách khác nhau để tách tế bào sừng như sử dụng kháng thể, chất nền cho tế bào bám dính nhanh như collagen…. Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng phương pháp nuơi cấy trong mơi trường chọn lọc để thu nhận riêng tế bào sừng. Các tế bào Merkel và tế bào Langerhans khơng sống sĩt trong nuơi cấy, các tế bào hắc sắc tố khơng tăng sinh ngoại trừ dưới các điều kiện nuơi đặc biệt. Do đĩ, các tế bào này sẽ dễ dàng bị rửa trơi trong quá trình nuơi cấy. Hình 2.4 cho thấy trong quần thể tế bào rời thu nhận được sẽ chứa các tế bào lớp trên của biểu bì và các tế bào lớp đáy. Tế bào sừng chiếm 90% tổng số tế bào của lớp biểu bì. Tuy nhiên, chỉ cĩ hai quần thể tế bào sừng của lớp đáy cĩ khả năng tăng sinh là tế bào gốc biểu bì chiếm 10% và tế bào khuếch đại chuyển (dạng trung gian của tế bào gốc và tế bào biệt hĩa cuối cùng) chiếm 50%. Do đĩ, để nhân được tế bào sừng, điều đặc biệt quan trọng là phải thu nhận được quần thể tế bào lớp đáy.
Kết quả từ Bảng 3.4 cho thấy số tế bào sống tách được (trung bình 656,4 ± 19,8 x 104/cm2 mơ da) và tỷ lệ tế bào sống (trung bình 82,75% ± 1,86) thỏa mãn yêu cầu để nuơi cấy. Với 1cm2 mơ da, số tế bào sống phân lập được đủ để nuơi trong 1 chai cĩ diện tích 25cm2.
Theo kết quả Hybbinette và cs. đã cơng bố, việc phân lập tế bào sừng từ mẫu da bằng cách ủ với trypsin/EDTA (mật độ tế bào 4,0 x 106 tế bào/cm2) cho kết quả cao hơn hẳn so với việc sử dụng thermolysin (2,8 x 106
tế bào/cm2), Dispase (2,3 x 106 tế bào/cm2), chỉ cĩ trypsin (1,1 x 106 tế bào/cm2), sau đĩ xử lý với trypsin/EDTA.
Theo kết quả García Fernández và cs. đã cơng bố, việc phân lập tế bào sừng từ mẫu da bằng cách ủ trypsin lạnh (mật độ 2,1 x 106 tế bào/cm2), sau đĩ xử lý trypsin/EDTA, cao hơn so với việc sử dụng trypsin ấm (0,4 x 106 tế bào/cm2), Dispase (1,1 x 106 tế bào/cm2), sau đĩ xử lý trypsin/EDTA.
Như vậy, mật độ tế bào rời thu được trong thí nghiệm này (6,5 x 106
tế bào/cm2) cao hơn so với cơng bố của Hybbinette và cs. (4,0 x 106 tế bào/cm2) và García Fernández và cs. (2,1 x 106
tế bào/cm2). Hơn nữa, tỷ lệ tế bào sống thu được trong thí nghiệm này (trung bình 82,75%) cũng cao hơn kết quả do García Fernández và cs. khảo sát (trung bình 81%).
Tĩm lại, quy trình tách tế bào sừng từ mơ da bằng phương pháp trypsin lạnh cho kết quả tốt và sẽ được dùng làm phương pháp để tách tế bào sừng làm nguyên liệu cho nghiên cứu. Tỷ lệ tách tế bào thành cơng là 90% .