- Khĩ đánh giá sự dung nạp
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN NỘI DUNG 1:
3.1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của màng collagen đến pH mơi trường nuơi tế bào sừng
nuơi tế bào sừng
Màng collagen đã bảo quản bằng phương pháp lạnh sâu (-80oC) và khơ tự nhiên được khảo sát ảnh hưởng đến sự thay đổi pH mơi trường SFM.
Sự thay đổi pH của mơi trường SFM theo các mốc thời gian khi cĩ ngâm màng collagen được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của màng collagen đến sự thay đổi pH
của mơi trường SFM. Thời gian
khảo sát (giờ)
pH theo phương pháp bảo quản màng
Thời gian khảo sát
(giờ)
pH theo phương pháp bảo quản màng Lạnh sâu Khơ tự nhiên Lạnh sâu Khơ tự nhiên 0 6,82 ± 0,09 6,82 ± 0,09 96 6,79 ± 0,04 6,85 ± 0,07 12 6,96 ± 0,04 6,98 ± 0,02 108 6,90 ± 0,05 6,82 ± 0,02 24 6,98 ± 0,03 6,80 ± 0,04 120 6,96 ± 0,07 6,91 ± 0,10 36 6,99 ± 0,06 6,90 ± 0,02 132 6,98 ± 0,05 6,92 ± 0,10 48 6,98 ± 0,05 6,95 ± 0,03 144 6,97 ± 0,04 6,94 ± 0,11 60 7,01 ± 0,04 7,00 ± 0,06 156 6,96 ± 0,04 6,94 ± 0,08 72 6,83 ± 0,03 6,82 ± 0,03 168 6,80 ± 0,01 6,74 ± 0,02 84 6,84 ± 0,02 6,80 ± 0,02
Bảng 3.2. cho thấy pH mơi trường SFM dao động trung bình từ 6,79 ± 0,04 – 7,01 ± 0,04 (đối với màng collagen được bảo quản lạnh sâu), từ 6,74 ± 0,02 – 7,00 ± 0,06 (đối với màng collagen bảo quản khơ tự nhiên).
BÀN LUẬN
Một trong những yêu cầu để được ứng dụng lâm sàng là tính an tồn của màng collagen. Màng collagen tươi cĩ thời gian sử dụng rất ngắn, cĩ khả năng truyền bệnh do vi khuẩn, nấm, virus từ người cho. Do đĩ, màng collagen cần được xử lý và khử trùng. Bức xạ gamma là tác nhân hiệu quả và đáng tin cậy nhất. Liều 25 kGy đã được khuyến cáo để khử trùng các mơ đồng ghép và được ứng dụng thơng thường trong nhiều ngân hàng mơ. Đây là liều chiếu khử trùng phổ biến, khơng gây ảnh hưởng đến thành phần acid amin, các nhân tố tăng trưởng của màng. Màng ối được chiếu xạ liều 25 kGy đã được chứng minh cĩ khả năng ngăn thấm các dịng vi khuẩn Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia coli, Flavimonas, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus.
Do đĩ, sau khi tạo ra, màng collagen được đĩng gĩi và khử trùng bằng chiếu xạ tia gamma từ nguồn Co60 với suất liều 25 kGy.
41 Kết quả từ Bảng 3.1 cho thấy màng collagen được tạo ra an tồn, đạt các tiêu chuẩn quy định về sản phẩm dùng cho bỏng, các vết loét sâu theo các quyết định của Bộ Y tế (Quyết định 3113/1999/QĐ-BYT, Quyết định 229/QĐ-BYT) .
Việc đánh giá các chỉ tiêu này (kích ứng da, độc tính qua da, giới hạn nhiễm khuẩn) phù hợp với những yêu cầu của Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Tổ chức tiêu chuẩn hĩa quốc tế (ISO) về sản phẩm ghép da trong thời gian dài (hơn 30 ngày).
pH mơi trường sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến tế bào. Phần lớn các dịng tế bào tăng trưởng tốt ở pH 7,4. Tuy nhiên, pH tối ưu cho tế bào tăng trưởng cĩ thể thay đổi ở những dịng tế bào khác nhau. Riêng các tế bào biểu bì cĩ thể được duy trì ở pH 5,5.
So với pH mơi trường SFM ban đầu là 6,82 ± 0,09, pH mơi trường SFM sau khi ngâm màng collagen theo cả hai phương pháp bảo quản đều nằm trong khoảng pH giới hạn của mơi trường nuơi tế bào biểu bì. Điều này cho thấy, màng collagen an tồn đối với sự thay đổi pH mơi trường nuơi tế bào sừng sau bảy ngày ngâm. Đây cũng chính là khoảng thời gian tế bào sừng được nuơi tăng sinh trên màng collagen. Ngồi ra, màng collagen khơng cĩ hiện tượng bị tan rữa sau 7 ngày ngâm trong mơi trường SFM.
Như vậy, màng collagen được bảo quản bằng hai phương pháp (lạnh sâu và khơ tự nhiên) cĩ hoạt tính như nhau về độ an tồn (cho ứng dụng lâm sàng) và sự thay đổi pH mơi trường (cho nuơi cấy tế bào). Tuy nhiên, để bảo quản màng collagen theo phương pháp lạnh sâu, quy trình phức tạp hơn như cần sử dụng glycerol, tủ lạnh sâu… Do đĩ, màng collagen bảo quản theo phương pháp khơ tự nhiên được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nhận xét chung về kết quả chế tạo và đánh giá hoạt tính màng collagen từ màng ối:
- Sau khi loại hết lớp biểu mơ bằng cách lắc màng ối nguyên trong trypsin/EDTA 30 phút và cạo, sản phẩm thu được cĩ thành phần chủ yếu là collagen.
- Màng collagen được bảo quản bằng phương pháp để khơ tự nhiên, đạt các yêu cầu quy định của Bộ y tế về kích ứng da, độc tính qua da, giới hạn nhiễm khuẩn.
- Sau khi được ngâm và ủ trong mơi trường, màng collagen khơng bị tan rữa, giữ pH mơi trường trong khoảng thích hợp cho nuơi tế bào sừng.
42
Như vậy, quy trình chế tạo màng collagen từ màng ối người được tĩm tắt như sau:
Màng ối được thu nhận trong DPBS – kháng sinh
Rửa, lắc trong DPBS cho sạch máu
Cạo bỏ lớp tế bào biểu mơ
Đĩng gĩi
Lắc trong trypsin/EDTA 30 phút, 37o
C
Để khơ tự nhiên trong tủ cấy khoảng 2 giờ
Chiếu xạ bằng tia , suất liều 25kGy
Bảo quản ở nhiệt độ phịng
43
NỘI DUNG 2: