- Khĩ đánh giá sự dung nạp
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG ỨNG DỤNG GHÉP TỰ THÂN
3.3. Kết quả nhân khối tế bào sừng
Khi vừa đưa vào mơi trường nuơi, các tế bào rời cĩ nhiều hình dạng khác nhau như trịn, que, đa diện … Điều này là do hỗn hợp tế bào tách được ngồi tế bào sừng cịn cĩ nguyên bào sợi, tế bào hắc sắc tố, tế bào Langerhans, tế bào Merkel… Sau một ngày nuơi sơ cấp, các tế bào bắt đầu bám dính vào bề mặt chai nuơi một cách rời rạc, từng tế bào riêng rẽ. Các cụm tế bào được hình thành sau 3- 4 ngày. Hình dạng tế bào trở nên đồng nhất hơn từ ngày 5. Sau đĩ, các cụm tế bào này lớn dần và hợp vào nhau tạo thành lớp đơn trên bề mặt chai nuơi sau 7 ngày.
47 Kết quả nuơi sơ cấp tế bào sừng được trình bày trong Hình 3.25.
Sau khi tế bào tăng sinh chiếm khoảng 70% diện tích mặt đáy chai nuơi, tiến hành cấy chuyền lần thứ nhất vì ở mật độ cao (mức độ hợp dịng cao), các tế bào trong mơi trường Ca2+
thấp bắt đầu biệt hĩa.
Hình 3.24. Kết quả nuơi cấy tế bào sừng in vitro. Tế bào được nuơi sơ cấp: tạo
cụm vào ngày 3 (a) (40X); các cụm lớn hơn vào ngày 4 (b) và ngày 5 (c) (40X); lớp đơn vào ngày 7 (d) (40X), (e) (100X), (f) (200X).
A F F C B E D
48 Kết quả theo dõi sự tăng sinh tế bào sau lần cấy chuyền thứ nhất bằng cách xác định mật độ tế bào sống trong chai nuơi được trình bày trong Đồ thị 3.1.
B +
Đồ thị 2.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng sau lần cấy chuyền thứ nhất
Đồ thị 2.1 cho thấy sau khi được cấy chuyền, tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 2 đến ngày 7, đạt cao nhất vào ngày 7, sau đĩ giảm nhanh đến ngày 10. Điều này chứng tỏ tế bào đã đạt mức độ tăng sinh tối đa vào ngày thứ 7. Thời gian nhân đơi
Đồ thị 3.1. Đường cong tặng trưởng của tế bào dựa vào mật độ tế bào. BÀN LUẬN
Các tế bào sừng tạo dịng cĩ tính khơng đồng nhất về khả năng tăng trưởng. Khi được nuơi cấy in vitro, ba dịng tế bào sừng hình thành là paraclone,
meroclone, và holoclone. Holoclone hình thành những cụm lớn và trịn, gồm các tế bào gốc biểu bì. Holoclone cĩ khả năng tăng sinh lớn nhất. Paraclone do các tế bào khuếch đại chuyển tạo ra, hình thành những cụm nhỏ và khơng đều. Paraclone chứa các tế bào cĩ tiềm năng tăng trưởng rất hạn chế (tối đa 15 lần phân chia). Meroclone tạo ra những cụm khơng cĩ viền trơn và nhỏ hơn các cụm do holoclone tạo ra. Meroclone gồm hỗn hợp các tế bào cĩ tiềm năng tăng trưởng khác nhau, là giai đoạn chuyển tiếp giữa holoclone và paraclone. Quá trình chuyển từ holoclone đến meroclone đến paraclone là một quá trình đơn hướng, khơng thuận nghịch, xảy ra chậm chạp trong suốt quá trình nuơi cấy lặp lại tế bào sừng nhưng sẽ xảy ra rất nhanh nếu điều kiện nuơi cấy khơng thích hợp. Do đĩ, các điều kiện nuơi cấy khơng thích hợp cĩ thể khiến cho các tế bào gốc “biến mất” nhanh chĩng, làm cho hiệu quả ghép tự thân kém đi.
Mơi trường nuơi sơ cấp là mơi trường DMEM chứa 20% huyết thanh được sử dụng vào lúc đầu để kích thích các tế bào sừng vừa tách ra từ biểu bì bám dính vào bề mặt chai nuơi. Ngay khi các tế bào bám dính, mơi trường nuơi sơ cấp được thay đổi bằng mơi trường khơng chứa huyết thanh SFM để các tế bào sừng tăng trưởng. Mơi trường SFM sẽ được sử dụng cho tất cả các giai đoạn sau cho đến khi ghép trên bệnh nhân. 0.58 1.73 1.82 2.24 1.81 0.94 0.27 0.52 0.8 0 0.5 1 1.5 2 2.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ngày S T B x 1 0 4 /cm 2
49 Mơi trường SFM là mơi trường thích hợp để nhân số lượng tế bào sừng người mà khơng cần bổ sung dịch trích tuyến yên bị hoặc sử dụng lớp nuơi dưỡng nguyên bào sợi (yếu tố bắt buộc trong quy trình nuơi tế bào sừng đầu tiên do Rheinwald và Green thiết lập năm 1975. Hoạt tính kích thích tăng trưởng tế bào của dịch trích tuyến yên bị được thay thế bằng các nhân tố kích thích tăng trưởng thích hợp. Các nhân tố kích thích tăng trưởng này cũng duy trì hình thái, các yếu tố đánh dấu (marker) sinh lý của tế bào. Mơi trường SFM cĩ nồng độ Ca2+ thấp để ức chế sự biệt hĩa tế bào sừng, cho phép phân lập và nuơi cấy làm giàu các quần thể tế bào sừng chưa biệt hĩa. Mơi trường SFM cũng kìm hãm sự tăng sinh của nguyên bào sợi, là loại tế bào cĩ tốc độ tăng trưởng nhanh, lấn át các loại tế bào khác của da khi được nuơi cấy. Khi tách tế bào bằng phương pháp trypsin lạnh (nhiệt độ ủ là 4oC), tỷ lệ nhiễm nguyên bào sợi trung bì là dưới 0,1%. Nếu tách tế bào bằng phương pháp trypsin ấm (nhiệt độ ủ là 37o
C), tỷ lệ nhiễm nguyên bào sợi trung bì là dưới 1%.
Kết quả từ Hình 2.5 cho thấy các tế bào bám trên bề mặt chai nuơi cĩ dạng hình đa giác, là một đặc trưng về hình dạng của tế bào sừng được nuơi cấy.
Như vậy, số tế bào được phân lập từ 1cm2 da đủ để nuơi trong 1 chai 25cm2, đến ngày thứ 7 tế bào đã tăng sinh và chiếm đầy chai. Sau khi cấy chuyền lần thứ nhất ra 2 chai nuơi mới, sau 7 ngày tế bào sẽ tăng sinh đầy chai. Do đĩ, sau 14 ngày nuơi, từ 1cm2 da ban đầu cĩ thể thu nhận được diện tích 50cm2 tế bào sừng. Điều này rất quan trọng trong việc tính tốn để thu nhận mẫu da và thời gian nuơi cấy, nhân tế bào thích hợp cho việc cấy ghép trên bệnh nhân. Tỷ lệ nuơi tế bào thành cơng là 100%.
Nhận xét chung về kết quả phân lập, nuơi cấy tăng sinh tế bào sừng từ mơ da:
- Sau khi ủ mơ da trong trypsin/EDTA 18 giờ ở 4oC, số tế bào sống tách được đạt trung bình 656,4 x 104 tế bào/cm2 mơ da, tỷ lệ tế bào sống đạt trung bình 82,75%. Với 1cm2 mơ da, số tế bào sống phân lập được đủ để nuơi trong 1 chai cĩ diện tích 25cm2.
- Tế bào sừng cĩ khả năng tăng sinh, tạo cụm và đạt lớp đơn sau 7 ngày nuơi trong mơi trường khơng huyết thanh. Sau 14 ngày nuơi (qua một lần cấy chuyền), từ 1cm2 da ban đầu cĩ thể thu nhận được diện tích 50cm2 tế bào sừng.
50
Như vậy, quy trình phân lập, nuơi cấy tăng sinh tế bào sừng người trong mơi trường khơng huyết thanh được rút ra như sau:
Mẫu da được thu nhận trong DPBS – kháng sinh
Rửa trong DPBS, loại bỏ lơng, mỡ, một phần lớp trung bì
Cắt thành từng mảnh nhỏ
Tách rời lớp biểu bì và lớp trung bì
Thay mơi trường sơ cấp bằng mơi trường khơng huyết thanh Ủ trong trypsin 0,25% - EDTA
0,02% (tỷ lệ 1 - 4) 18 giờ, 4oC
Huyền phù để thu nhận tế bào sừng rời
Nuơi tế bào trong mơi trường sơ cấp ở 37oC, 5% CO2 với mật độ 3 x 105 tế bào/cm2
bề mặt chai nuơi trong 2 ngày
Nuơi tế bào ở 37oC, 5% CO2, thay mơi trường 2 ngày/lần
51