CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến xác định kháng nguyên ENRO sử dụng đầu thu sinh
4.2.3. Đặc trưng quang phổ Raman
Theo lý thuyết phổ tán xạ Raman thì kháng nguyên ENRO có các vạch phổ Raman đặc trưng tại 714, 1255, 1360, 1388, 1481 cm-1 như trình bày trên hình 4.8. Trong đó, vạch phổ đặc trưng tại 1388, 1481, 1255 cm-1 theo thứ tự lần lượt là dao động của liên kết O-C-O, dao động của mạch vòng benzene và dao động uốn cong của liên kết C-H [23], [24].
80
Hình 4.8. Quang phổ Raman của phân tử ENRO.
Hình 4.9. Phổ tán xạ Raman cảm biến ENRO-MIP/AuNPs-SPCE qua từng bước công nghệ chế tạo và tái liên kết kháng nguyên ENRO.
Chúng tôi đã tiến hành đo phổ Raman qua từng bước chế tạo cảm biến. Kết quả được trình bày trên hình 4.9. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành đo phổ Raman của điện cực mực in các bon được phân tán bởi lớp hạt nano Au có kích thước nằm trong khoảng từ 20-70 nm. Trên phổ Raman ghi nhận hai vạch phổ tại 1579 cm-1 và 1337 cm-1. Đây chính là vạch phổđặc trưng của dao động liên kết C-C trong mạng các bon (G-band) và khuyết tật trong mạng các bon (D-band) [25]. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành tạo màng SAM của p-ATP trên điện cực AuNPs-SPCE và tiến hành đo quang phổRaman. Đặc trưng quang phổ cho thấy xuất hiện ba vạch phổ tại: 1081, 1143 và 1181 cm-1tương ứng với hai dao động liên kết C-S và C-C, hai dao động liên kết C- N và dao động uốn cong C-H [26]. Điều này chứng tỏ sự có mặt của màng SAM (p- ATP) trên bề mặt điện cực.
81
Tiến hành cốđịnh kháng thể ENRO lên bề mặt điện cực SAM (p-ATP)/AuNPs- SPCE. Kết quảđo Raman cho thấy ngoài các vạch phổ kể trên còn xuất hiện thêm 3 vạch phổ tại 1272, 1349, 1428 cm-1. Do kháng thể ENRO thuộc nhóm IgG2 nên có các vạch phổđặc trưng tại 1245, 1342, 1443 cm-1 tương ứng với dao động của nhóm Amide III và dao động uốn cong của nhóm C-H2 [27]. Như vậy kết quả Raman cho thấy kháng thể ENRO đã được cố định thành công trên bề mặt điện cực AuNPs-SPCE thông qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -COOH của kháng thể với nhóm -NH2 của màng SAM (p-ATP). Sau khi nhỏ kháng nguyên ENRO lên trên điện cực đã được cố định kháng thể ENRO, chúng tôi ghi nhận thêm sự xuất hiện của các vạch phổRaman đặc trưng dao động uốn cong của liên kết C-H, dao động co dãn của liên kết O-C-O và dao động rung của vòng benzene trong kháng nguyên ENRO tại 1235, 1388, 1428 cm-1 [23], [24]. Điều này chứng tỏđã xảy ra tương tác liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể trên bề mặt điện cực. Để tạo đầu thu sinh học nhân tạo MIP của kháng nguyên ENRO, chúng tôi tiến hành polyme hóa tạo màng poly(aminothiophenol) MIP. Kết quả đo quang phổ Raman cho thấy cường độ vạch phổ đặc trưng của SAM (p-ATP) tăng mạnh do số lượng phân tử p-ATP tăng. Tuy nhiên, do sự phát triển của mạng polyme bao quanh kháng nguyên và kháng thể ENRO nên vạch phổRaman đặc trưng cho dao động của các liên kết trong kháng nguyên và kháng thể có độ phân biệt nhỏ so với các vạch phổđặc trưng khác. Sau bước loại bỏ kháng nguyên ENRO ra khỏi màng polyme MIP, trên đặc trưng quang phổ Raman hoàn toàn không tồn tại các vạch phổ đặc trưng của kháng nguyên ENRO. Chứng tỏ rằng các phần tử kháng nguyên ENRO đã được loại bỏ ra khỏi màng polyme MIP sau bước áp thế tĩnh trong môi trường axít và để lại các khuôn in đặc hiệu của kháng nguyên ENRO. Các khuôn in đặc hiệu này được gọi là đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP. Để khẳng định tính đặc hiệu của khuôn in, chúng tôi tiến hành nhỏ kháng nguyên ENRO lên bề mặt điện cực chứa khuôn in và đo quang phổRaman. Trên đặc trưng quang phổ Raman có sự xuất hiện trở lại của các vạch phổ đặc trưng của kháng nguyên ENRO. Điều này chứng tỏđã có sự tái liên kết giữa kháng nguyên ENRO và đầu thu sinh học nhân tạo của nó (tức là các khuôn in đặc hiệu). Tại nồng độ kháng nguyên ENRO là 1 ng/mL và 10 ng/mL, cường độ vạch phổ tăng một cách rõ rệt. Tuy nhiên, tại nồng độ100 ng/mL thì cường độ vạch phổ không có sự khác biệt nhiều so với nồng độ 10 ng/mL. Chúng tôi cho rằng là do số lượng kháng nguyên ENRO tái liên kết với khuôn in đặc trưng không tăng, do không có đủ khuôn in đặc trưng để tái liên kết. Kết quả này trùng khớp với phương pháp đo điện hóa (EIS) đã thực hiện, cảm biến hoạt động tốt trong dải nồng độ kháng nguyên ENRO từ1 đến 10 ng/mL. Như vậy, phép đo quang phổ Raman cho thấy đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP đã được chế tạo thành công theo quy trình công nghệchúng tôi đưa ra ởchương 2. Trên bảng 4.1 trình bày vạch phổ Raman đặc trưng của một số chất/hợp chất/phân tử trong thực nghiệm có so sánh với giá trị lý thuyết.
82
Bảng 4.1. Vạch phổ đặc trưng của một số liên kết trên bề mặt điện cực cảm biến.
Điện cực Nhóm chức Tần sốdao động (cm-1) Lý thuyết Thực nghiệm Carbon D-Band 1350 1337 G-Band 1580 1579 Poly (Aminothiolphenol) Dao động của liên kết C-S và liên kết C-C 1074 1081 Dao động của liên kết C-N và liên kết C-H 1140 1188 1143 1181 Kháng thể ENRO Amide III 1245 1272 Amide III 1342 1349 Dao động uốn cong của C-H2 1453 1428 Kháng nguyên ENRO Dao động uốn cong của C-H 1255 1235 Dao động của liên kết O-C-O 1388 1388 Dao động rung của vòng
benzen 1481 1481