CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1. Khảo sát hoạt động của cảm biến miễn dịch sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên
tạo kháng nguyên ENRO-MIP đểxác định nồng độ kháng nguyên ENRO trong dung dịch bằng phương pháp đo phổ tổng trở faradic. Bộ phận chuyển đổi (transducer) của cảm biến là điện cực mực in các bon (SPCE) được phủ lớp hạt nano vàng (AuNPs) phân tán đều trên bề mặt bằng phương pháp điện hóa quét thế tuần hoàn. Phép đo quang phổRaman được thực hiện sau mỗi bước chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo MIP nhằm xác định sự có mặt hoặc vắng mặt của phân tử chất in (kháng nguyên ENRO) trong mạng polyme MIP. Phương pháp quang phổ Raman dựa trên cơ sở tán xạ của chùm ánh sáng đơn sắc khi chiếu vào mẫu đo, tạo ra ánh sáng tán xạ Raman được ghi nhận lại bằng phần tử thu quang. Vạch phổ Raman cung cấp thông tin vềdao động phân tử và cấu trúc tinh thể. Quang phổRaman được sử dụng rộng rãi trong phân tích các hợp chất hữu cơ do mỗi nhóm chức hữu cơ có đặc trưng riêng về tần số hấp thụ. Dựa vào cường độđỉnh phổ Raman cho biết định lượng của nồng độ chất. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đã khảo sát hoạt động của cảm biến sử dụng đầu thu sinh học enzyme HRP xác định nồng độ H2O2 và cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo enzyme HRP-MIP để xác định enzyme HRP thông qua phản ứng oxy hóa - khử của enzyme HRP với H2O2 trong dung dịch đệm PBS (pH 6,0) bằng phương pháp quét thế tuần hoàn. Việc phát triển cảm biến này với mục đích tạo ra phương pháp kiểm tra chéo chứng minh tính đúng đắn của phương pháp phát triển cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tại MIP.
4.1. Khảo sát hoạt động của cảm biến miễn dịch sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên học tự nhiên
Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt động của của hai loại cảm biến miễn dịch sử dụng kháng thểENRO đã chế tạo bằng cách đo phổ EIS. Hoạt động của cảm biến được khảo sát trong dải nồng độ của kháng nguyên ENRO từ 1 đến 25 ng/mL. Kháng nguyên ENRO được pha trong PBS 10 mM pH 7,4. Nhỏ 2 μL dung dịch chứa kháng nguyên ENRO lên điện cực làm việc và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút đểđảm bảo xác xuất lớn nhất các phân tử ENRO liên kết với kháng thể. Sau đó, rửa sạch điện cực với nước cất để loại bỏ các phân tử không liên kết hoặc liên kết không bền vững. Điện cực được sấy nhẹ bằng dòng khí N2. Cuối cùng tiến hành đo phổ EIS trong dải tần số từ50 mHz đến 100 kHz với điện áp xoay chiều 10 mV trong dung dịch gồm K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 5 mM và KCl 0,1 M. Hình 4.1 trình bày đặc trưng phổ EIS của cảm biến tại các nồng độ kháng nguyên khác nhau. Kết quả cho thấy đường kính bán cung Nyquist (tương đương giá trị điện trở kháng truyền điện tử RCT) tăng tương ứng với nồng độ kháng nguyên ENRO. Sựtăng này có thể được giải thích là do kháng nguyên liên kết với kháng thể tạo thành một lớp điện môi ngăn cản quá trình truyền điện tử đến điện cực. Có thể nhận thấy, đường đặc trưng phổ EIS của hai loại cảm biến là gần giống nhau, bán cung đều tăng lên khi nồng độkháng nguyên tăng. Tuy nhiên, giá trị RCT của cảm
74
biến sử dụng màng SAM của p-ATP (cảm biến 1) lớn hơn so với cảm biến sử dụng màng SAM của Cysteamine (cảm biến 2).
Hình 4.1. Đặc trưng phổ EIS của cảm biến miễn dịch sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên cố định trên màng SAM của a) p-ATP và b) Cysteamine.
Hình 4.2. Đường đặc trưng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của ΔRCT vào nồng độ kháng nguyên ENRO của hai cảm biến sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên.
Hình 4.2 trình bày đường đặc trưng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của ΔRCT vào nồng độ kháng nguyên ENRO của hai cảm biến. Kết quả cho thấy, cảm biến 1 có ΔRCT tăng trong dải nồng độ ENRO từ 1 đến 15 ng/mL và hệ sốxác định bội R2 là 0,970. Với cảm biến 2 thì R2đạt giá trị cao hơn, 0,980. Điều này chứng tỏ cảm biến 2 có độ tuyến tính tốt hơn cảm biến 1. Từđường đặc trưng chuẩn của cảm biến chúng tôi xác định được LOD của hai cảm biến 1 và 2 lần lượt là 0,1 ng/mL và 0,2 ng/mL. Giá trị LOD này cho thấy cảm biến có khảnăng ứng dụng ở mức độ chẩn đoán.
75
Để đánh giá độ chọn lọc của cảm biến đã chế tạo, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt động của cảm biến 2 trong các môi trường có chứa kháng nguyên/chất khác bao gồm kháng nguyên ENRO, kháng sinh Levofloxacin (LEVO) và kháng sinh Ciprofloxacin (CF).
Hình 4.3. Độ chọn lọc của cảm biến kháng thể ENRO/SAM (Cysteamine)/AuNPs/SPCE trong các môi trường chứa các chất khác nhau: ENRO, LEVO, CF.
Trên hình 4.3 trình bày tín hiệu của cảm biến tại các nồng độ 5, 10, 15, 20 ng/mL, Kết quả cho thấy, tín hiệu thu được của cảm biến trong môi trường kháng nguyên PSA, hay kháng sinh Levo hoặc kháng sinh CF là rất nhỏkhông đáng kể so với tín hiệu của cảm biến (khoảng 3%). Điều này chứng tỏ cảm biến có độ chọn lọc cao. Tuy nhiên, độ nhạy của cảm biến vẫn còn tương đối thấp. Nếu áp dụng công thức tính độ nhạy là:
𝑥𝑥 =𝑛𝑛ồ𝑛𝑛𝑛𝑛∆𝑅𝑅độ𝐶𝐶𝐶𝐶 ( (𝑛𝑛𝑛𝑛Ω)/𝑚𝑚𝐿𝐿)
thì cảm biến 1 có độ nhạy là 101 Ω/ng. mL-1 và cảm biến 2 là 83 Ω/ng. mL-1. Vì vậy, chúng tôi đặt mục tiêu tiếp tục nghiên cứu để tăng độ nhạy của cảm biến cũng như khắc phục nhược điểm của cảm biến này như yêu cầu môi trường bảo quản khắt khe, dễ bị mất hoạt tính sinh học, chỉ sử dụng một lần,… Công nghệ polyme in phân tử (MIP) sử dụng chế tạo đầu thu sinh học là một trong những công nghệ tiềm năng. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo sử dụng phát hiện và xác định kháng nguyên ENRO theo công nghệ MIP.
76