trình chế tạo
Hình 5.41. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện QCM.
Trên hình 5.41 trình bày nguyên lý hoạt động của cảm biến sử dụng linh kiện QCM. Linh kiện QCM có cấu trúc bánh kẹp giữa phiến tinh thể thạch anh (quartz) hướng AT-cut và điện cực vàng (Au). Khi đặt một điện áp xoay chiều có tần số thích hợp lên hai mặt của tinh thể thạch anh AT-cut, tinh thể sẽ dao động theo mode dao động trượt dọc theo bề mặt tinh thể. Khi tần sốdao động riêng của tinh thể thạch anh bằng tần sốdao động của điện áp đặt vào thì sẽ có hiện tượng cộng hưởng. Khi xét dao động của linh kiện QCM trong môi trường chất lỏng, độ dịch tần số cộng hưởng của linh kiện QCM phụ thuộc vào khối lượng các chất hấp phụ trên bề mặt và có mối liên hệtheo phương trình Sauerbrey:
130 6 2 2,3x10 fo m F A ∆ ∆ = − Trong đó: fo là tần sốdao động của linh kiện QCM,
∆m là sựthay đổi khối lượng trên bề mặt điện cực linh kiện QCM,
A là diện tích làm việc của linh kiện QCM.
Như vậy, dựa vào phương trình này chúng ta có thể xác định được độtăng khối lượng hấp phụ trên bề mặt của linh kiện QCM. Bằng phương pháp hóa học hoặc vật lý, các thành phần sinh học có thể gắn kết được lên bề mặt điện cực của linh kiện QCM, các thành phần sinh học này sẽtương tác với các tác nhân cần phát hiện dẫn đến khối lượng chất hấp phụ lên bề mặt của linh kiện QCM thay đổi. Sựthay đổi về khối lượng này sẽ dẫn đến sự suy giảm tần số cộng hưởng của linh kiện QCM. Cảm biến MIP-QCM xác định kháng sinh NOR được chế tạo theo công nghệ polyme in phân tử (MIP) sử dụng hệ quay ly tâm tích hợp chip vi lưu và linh kiện QCM. Lượng dung dịch dùng cho mỗi bước giảm từ 200 µL xuống còn 10 µL. Tốc độ quay là 1000 rpm, thời gian quay là 60 giây.
Hình 5.42. Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến MIP-QCM sử dụng chíp CMF.
Quy trình gồm có 4 bước được trình bày trên hình 5.42 bao gồm các bước cơ bản thông thường như đã trình bày ởchương 2. Tuy nhiên, trong trường hợp này, chíp CMF đã được sử dụng trong các bước chế tạo cụ thểnhư sau:
Bước 1: Tạo màng p-ATP SAM trên linh kiện QCM
Sử dụng dung môi ethanol để pha loãng p-ATP tới nồng độ 25mM. Sau khi cố định linh kiện QCM trên máy quay ly tâm, chúng tôi tiến hành nhỏ 10 µL p-ATP vào đầu vào của chíp overflow CMF. Sau đó tiến hành quay ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút, thời gian 60 giây. Với phương pháp này dung dịch p-ATP đã trải đều trên bề mặt QCM mà không tốn quá nhiều dung dịch như phương pháp thông thường
131
(sử dụng flow cell). Sau đó, để qua đêm tại nhiệt độ phòng, trong tối (khoảng 14 giờ). Sau đó rửa sạch điện cực cũng như loại bỏ các liên kết yếu trên bề mặt bằng cách sử dụng chíp siphon CMF. Lúc này, lượng dung dịch rửa (PBS 10 mM) sẽ được tăng lên15 µL, tốc độ quay giữ nguyên 100 rpm trong 60 giây. Lặp lại việc rửa này vài lần đểđảm bảo loại bỏ hết các liên kết yếu trên bề mặt điện cực. Sau đó sấy khô nhẹ bằng khí Nitơ và tiến hành bước tiếp theo.
Bước 2: Gắn các phân tử chất cần phân tích
Trong bước này các phân tử chất cần phân tích (Norfloxacin-NOR) được gắn lên bề mặt điện cực bằng lực hút tĩnh điện giữa đế và phân tử. Đưa điện cực đã có màng SAM thu được ở bước trên vào buồng giữ mẫu (holder). Nhỏ 500 μL dung dịch NOR 1 mM vào buồng rồi đặt thêm điện cực đối (counter electrode) Pt và điện cực chuẩn (reference electrode) Ag/AgCl vào buồng để tiến hành điện hóa. Lúc này, điện cực QCM đóng vai trò là điện cực làm việc. Tiến hành áp thế -600 mV vs. Ag/AgCl trong khoảng thời gian 600s. Lúc này các nguyên tử Nitơ trong nhóm - NH bị proton hóa thành nhóm -NH2+. Điện thế âm sẽ kéo các phân tử NOR với nhóm chức -NH2+ lại gần bề mặt điện cực QCM. Sau đó tiến hành rửa điện cực loại bỏ phân tử NOR dư và phân tử NOR liên kết yếu trên màng SAM giống hệt như cách rửa áp dụng trong bước 1.
Bước 3: In phân tử NOR vào mang polyme p-ATP
Dung dịch tiến hành polyme bao gồm monome p-ATP 6,25 mM, phân tử in NOR 1,25 mM được pha trong dung dịch đệm PBS 50 mM có chứa KCl 100 mM. 500µL dung dịch này được đưa vào buồng giữđiện cực thu được ởbước 2 có đặt điện cực đối (counter electrode) Pt và điện cực chuẩn (reference electrode) Ag/AgCl. Tiến hành quét thế tuần hoàn trong dải điện áp từ -200 mV đến +800 mV vs. Ag/AgCl với tốc độ quét là 50 mV/s với sốvòng quét là 10 vòng. Màng polyme được hình thành thông qua liên kết polyme liên hợp của cặp electron của nguyên tửnitơ của phân tử p-ATP, tạo thành chuỗi polyme ATP có cấu trúc xen kẽ giữa vòng phenyl và nhóm chức chứa gốc nitơ.
Bước 4: Loại bỏ phân tử NOR bằng phương pháp áp thế tĩnh điện
Tách phân tử NOR ra khỏi màng polyme bằng phương pháp áp thếtĩnh tương tự như ởbước 2 nhưng với điện áp +600mV vs. Ag/AgCl trong 600s và trong dung dịch HCl 1M. Điện cực sau đó được rửa sạch sử dụng chíp vi lưu như các bước ở trên rồi sấy nhẹ bằng dòng khí Nitơ và sẵn sàng cho bước đo đạc tiếp theo.
Để theo dõi tính hiệu quả và sự thành công của từng bước trong quy trình chế tạo, sau mỗi bước, điện cực được lắp vào hệ đo Mass-Sensitive System Biosensor do nghiên cứu sinh thiết kế(hình 5.43) đểđo tần số cộng hưởng.
132
Hình 5.43. Hệ đo Mass-sensitive system biosensor thực hiện việc đo đáp ứng tần số của
điện cực cảm biến MIP-QCM sau mỗi bước chế tạo trong môi trường dung dịch PBS 10mM.
Trên hình 5.44 trình bày đáp ứng tần số của linh kiện QCM và linh kiện QCM sau mỗi bước chế tạotrong dung dịch PBS 10 mM. Đầu tiên chúng tôi đo tần sốthay đổi theo thời gian của linh kiện QCM.
0 20 40 60 80 100 5004400 5004600 5004800 5005000 5005200 5005400 5005600 5005800 Frequenc y res pons e ( H z ) Time(s) 200 400 600 800 1000 Bare QCM SAM-QCM NOR-MIP/QCM NOR removal-MIP-QCM 1 µM NOR rebinding/QCM 0
MIP-QCM sensor for NOR detection
Hình 5.44. Sự thay đổi tần số theo thời gian của các bước chế tạo và hoạt động của cảm
biến MIP-QCM xác định kháng sinh NOR.
Kết quả cho thấy tần số ổn định ở 5005600 Hz. Đây chính là tần số cộng hưởng của linh kiện QCM theo đúng giá trị niêm yết của nhà sản xuất. Sau khi tạo màng p- ATP SAM (sau bước 1), tần số giảm mạnh và ổn định tại giá trị5005500 Hz (đường màu đỏ trên hình 5.44). Sự suy giảm cho thấy trên bề mặt điện cực QCM đã hình thành một lớp màng SAM p-ATP. Hơn nữa, tần số rất ổn định, tuyệt đối giữ không
133
đổi sau thời gian dài (1000s), điều mà chúng tôi chưa bao giờquan sát được đối với điện cực rửa bằng cách sử dụng bình tia thông thường. Có thể nói với cách rửa bằng chíp vi lưu rất hiệu quả trong việc loại bỏ các liên kết SAM yếu trên bề mặt điện cực. Sau khi tạo được màng NOR-MIP (bước 3), chúng tôi nhận thấy tần số sụt giảm mạnh cỡ762 Hz (đường màu xanh đậm trên hình 5.44). Và cũng quan sát được đáp ứng tần số rất ổn định trong thời gian này. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tổng hợp thành công màng polyme MIP trên điện cực QCM và loại bỏ được hết các thành phần hóa/sinh học dư thừa sau phản ứng. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành loại bỏ phân tử NOR trong mạng polyme và tiến hành đo tần số với kết quảlà đường màu hồng trên hình. Chúng tôi nhận tần sốtăng, ổn định tại tần số 5005160 Hz và có khác biệt với tần số của linh kiện QCM sau bước polyme hóa là 323 Hz. Điều này chứng tỏ một lượng lớn các phân tửNOR đã bị tách khỏi mạng polyme MIP. Đểđánh giá tính chọn lọc đặc hiệu của các khuôn nhận dạng phân tửNOR, chúng tôi đã nhỏ 10 µL dung dịch NOR nồng độ 1 µM vào đầu vào của chip vi lưu và quay tốc độ 1000 rpm trong 60 giây. Điện cực được để ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút. Sau đó chúng tôi tiến hành rửa điện cực, sấy khô và bơm 1 mL dung dịch PBS 10 mM vào buồng chứa và tiến hành đo tần số. Kết quả(đường màu xanh rêu trên hình 5.44) cho thấy tần số giảm mạnh cỡ 680 Hz (so với điện cực MIP-QCM đã loại bỏ phân tửNOR). Điều này chứng tỏ các phân tửNOR đã tái liên kết với các khuôn nhận dạng đặc hiệu NOR trong mạng polyme MIP trên bề mặt điện cực. Như vậy thông qua việc đo sựthay đổi tần sốqua các bước chế tạo cho thấy chúng tôi đã chế tạo thành công cảm biến MIP- QCM và tính hiệu quả của chip vi lưu quay ly tâm sử dụng trong bước rửa.
Như vậy, theo nguyên tắc sử dụng các kênh vi dẫn và dùng lực ly tâm để tác dụng một lực đủ lớn đã cho phép gắn hiệu quả mẫu sinh học lên bề mặt điện cực cảm biến sinh học. Thiết bị này cho phép sử dụng một lượng mẫu nằm khoảng từ5 đến 20µL, thay vì khoảng từ2 đến 5mL để gắn mẫu lên cảm biến. Điều này tiết kiệm được một lượng mẫu rất lớn, chỉ còn khoảng 1/1000 so với phương pháp gắn thông thường, giúp giảm chi phí xét nghiệm. Ngoài ra, việc sử dụng lực ly tâm, thiết bị cho phép gắn mẫu nhanh, đồng đều, không mất thời gian chờnhư phương pháp thông thường. Hơn nữa, thiết bịvi lưu để gắn mẫu lên cảm biến sinh học cho phép gắn mẫu tập trung trong phần diện tích cần gắn mẫu trên cảm biến sinh học, điều này giúp giảm được các phản ứng phụ gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. Bằng cách bố trí các kênh vi dẫn và khoang gắn mẫu phủ lên phần diện tích cần gắn mẫu của cảm biến sinh học, thiết bị đảm bảo phần mẫu chỉ được gắn lên phần diện tích cần thiết, ngoài ra, với việc điều khiển tốc độly tâm, cho phép điều khiển được mật độ của mẫu gắn lên cảm biến. Điều này vừa tiết kiệm được mẫu vừa đảm bảo khảnăng gắn kết nhanh, đồng đều của mẫu lên bề mặt cảm biến giúp tăng độ chính xác cũng như độ nhạy của cảm biến sinh học. Bằng cách sử dụng vi kênh lắp ghép được tạo ra ngay trên bề mặt cảm biến sinh học và sử dụng lực ly tâm để gắn mẫu cho phép loại bỏ được vấn đề bọt khí, ngoài ra, với thiết kế này, việc tháo, lắp và vệsinh vi kênh được dễ dàng, có khả năng tái sử dụng cao. Thiết bị vi lưu này có thể dễ dàng áp dụng ngay trên các máy ly tâm sẵn có trong các phòng xét nghiệm mà không cần các thiết bị gắn phức tạp với
134
nhiều đường bơm. Bằng cách thiết kếđơn giản, dễ áp dụng, thiết bị cho phép thao tác dễ dàng, kiểm soát được thời gian và lượng mẫu sử dụng, giúp tiết kiệm nhân công và chi phí.
Kết luận chương
Công nghệ MIP một lần nữa đã được chứng minh về tính nổi trội trong ứng dụng chế tạo cảm biến phát hiện phân tử nhỏ. Bằng cách sử dụng thêm một số kỹ thuật kết hợp cùng với quá trình polyme như việc nhúng hạt nano vàng vào mạng polyme, hay tạo các mầm polyme trên điện cực trước khi polyme MIP đã làm tăng đáng kể độ nhạy và độ chọn lọc của cảm biến cũng như mở rộng được vùng làm việc tuyến tính và làm giảm được giới hạn phát hiện của cảm biến. Hơn nữa, cảm biến đã được khảo sát trong môi trường mẫu thực gồm nước hồ nuôi thủy sản và dược phẩm (thuốc viên nén và thuốc nhỏ mắt). Cảm biến đã phân tích chính xác lượng kháng sinh có trong các mẫu thực phù hợp với kết quảphân tích HPLC và phương pháp đo UV-vis. Kết quả mở ra định hướng ứng dụng trong phân tích nhanh dư lượng kháng sinh trong thủy hải sản và phát hiện nhanh tân dược giả.
Thiết kế và chế tạo thành công hệ thiết bịvi lưu ly tâm cho phép gắn một cách hiệu quả mẫu sinh học lên điện cực cảm biến. Bằng cách sử dụng vi kênh lắp ghép được tạo ra ngay trên bề mặt cảm biến sinh học và sử dụng lực ly tâm để gắn mẫu cho phép loại bỏ được vấn đề bọt khí, ngoài ra, với thiết kế này, việc tháo, lắp và vệ sinh vi kênh được dễ dàng, có khảnăng tái sử dụng cao. Thiết bị có thiết kếđơn giản, dễ áp dụng, thiết bị cho phép thao tác dễ dàng, kiểm soát được thời gian và lượng mẫu sử dụng, giúp tiết kiệm nhân công và chi phí.
135
KẾT LUẬN
1)Hai loại cảm biến sarcosine-MIP/EIS và E2-MIP/EIS đã được chế tạo thành công
với độ nhạy và độ chọn lọc phù hợp với yêu cầu chẩn đoán bệnh sớm và an toàn
thực phẩm. Các nghiên cứu cho thấy:
Các hạt vàng được phân tán trên bề mặt điện cực SPCE bằng phương pháp CV để tạo ra một lớp truyền dẫn mỏng nhưng nhạy cho việc chế tạo cũng như hoạt động của cảm biến MIP. Quá trình tạo hạt vàng được thực hiện bằng phương pháp điện hóa kết tủa trong dải điện áp từ -600 mV đến +500 mV vs. Ag/AgCl để tạo ra các hạt vàng trên bề mặt SPCE với mật độ, kích thước và hình dạng tốt và đồng đều.
Do sự khác biệt về tính chất dẫn điện của điện cực dẫn đến quá trình tổng hợp màng polyme MIP trên SPAuE và AuNPs-SPCE xảy ra với các tốc độ khác nhau. Do hiệu ứng của cường độ dòng điện thấp xuyên qua nền điện cực AuNPs-SPCE, màng polyme phát triển một cách chậm rãi từ bước polyme hóa ban đầu đến lúc bao phủ một lớp mỏng lên bề mặt các hạt nano vàng. Trong khi đó, độ dẫn điện của SPAuE cao hơn nhiều lần so với điện cực AuNPs-SPCE nên tốc độ phát triển polyme trên bề mặt điện cực rất nhanh, dẫn tới việc hình thành màng polyme dày và không đồng đều. Do vậy, tính đồng nhất của màng polyme MIP được tổng hợp trên AuNPs-SPCE tốt hơn trên điện cực SPAuE.
Mật độ hạt nano vàng phân bốtrên điện cực SPCE có ảnh hưởng rất lớn lên độ nhạy của cảm biến. Sau khi khảo sát, cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs- SPCE được chế tạo với lớp hạt vàng được hình thành sau 20 vòng quét cho độ nhạy tốt nhất, % ∆RCT đạt hơn 90% so với 51,9% và 66,1% của 15 và 10 vòng quét. Bề dày của màng polyme MIP ởđiều kiện 15 vòng quét trên điện cực AuNPs (20 CVs)-SPCE cho tín hiệu cao nhất với % ∆RCT đạt 93,3% so với 89,4% và 89,5% của 7 và 20 vòng quét tổng hợp màng polyme MIP. Như vậy ở điều kiện 20 vòng quét tạo lớp hạt nano vàng trên điện cực SPCE và 15 vòng quét tạo màng polyme MIP trên điện cực AuNPs-SPCE cho cảm biến có độ nhạy tối ưu.
Cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE hoạt động tốt với dải tuyến tính khá rộng từ 1 ng/mL đến 1,6 µg/mL (của nồng độ sarcosine) với độ dốc trung bình là 0,359. Ngược lại, cảm biến sử dụng điện cực mực in vàng sarcosine- MIP/SPAuE cho độ dốc cao hơn rất nhiều nhưng dải tuyến tính hẹp từ 1 ng/mL đến 600 ng/mL và bão hòa tại nồng độ lớn hơn 600 ng/mL. Kết quả này cho thấy cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE hoạt động tốt hơn cảm biến sarcosine-MIP/SPAuE ở dải nồng độ thấp.
Thực hiện các khảo sát tương tự như cảm biến sarcosine-MIP/EIS đối với cảm biến E2-MIP/EIS, giới hạn phát hiện (LOD) của cảm biến E2-MIP/EIS đạt 2 fM với diện tích điện cực cả biến là 2,64 mm2, dải làm việc tuyến tính